林明珍 趙磊

社區(qū)獲得性肺炎是呼吸系統(tǒng)常見疾病。成人CAP常見的致病菌為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等[1]，其治療多以經(jīng)驗性抗感染治療為主，經(jīng)常出現(xiàn)初治失敗，易使病情進展、延誤治療，甚至造成死亡，故在初治失敗后獲得具體病原菌資料顯得尤為重要。但目前病原學(xué)檢測方法存在一定的局限性，難以滿足臨床需求?；诤昊蚪M的二代測序技術(shù)因其高效、病原菌檢測率高等特點，已廣泛應(yīng)用于各種感染性疾病的病原體的檢測。本研究回顧性分析安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科2019年05月1日至2020年12月31日收治的87例初治失敗CAP患者送檢的mNGS的檢測結(jié)果進行分析，了解初治失敗CAP患者的病原菌分布情況，并與傳統(tǒng)病原菌檢測方法相比較，以期為臨床抗感染治療提供指導(dǎo)。

資料與方法

一、研究對象

2019年5月1日至2020年12月31日安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的87例初治失敗CAP患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合社區(qū)獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2)抗生素治療至少72小時后，體溫持續(xù)>38 ℃和(或)臨床癥狀(不適、咳嗽、咳痰、呼吸困難)仍存在[2]；具體標(biāo)準(zhǔn)如下：發(fā)熱>38 ℃且持續(xù)3天以上；呼吸道主要癥狀無改善或加重；胸部影像學(xué)有進展；抗生素升級；病情惡化需要機械通氣。當(dāng)入院第4天符合以上任意一條或以上，即考慮初治失?。?)同時進行了傳統(tǒng)病原學(xué)檢測及支氣管肺泡灌洗液高通量測序檢測。重癥CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下[3]: 包括2項主要標(biāo)準(zhǔn)和9項次要標(biāo)準(zhǔn)，符合下列1項主要標(biāo)準(zhǔn)或≥3項次要標(biāo)準(zhǔn)者即可診斷。主要標(biāo)準(zhǔn)：(1)氣管插管需要機械通氣；(2)感染性休克積極 液體復(fù)蘇后仍需要血管活性藥物。次要標(biāo)準(zhǔn)：(1)呼 吸頻率≥30次/min；(2)血氧分壓(PaO2)/吸氧分?jǐn)?shù)( FiO2)≤250；(3)多肺葉浸潤；(4)意識障礙和(或) 定向障礙；(5)血尿素氮≥20 mg/dl；(6)白細(xì)胞減少癥[白細(xì)胞<4×109/L]；(7)血小板減少癥[血小板<100×109/L] ；(8)體溫降低(中心體溫<36 ℃)；(9)低血壓需要液體復(fù)蘇。本研究共納入初治失敗CAP患者87例，其中男性60例(68.97%)，女性27例(31.03%)，年齡14～81歲，平均62.76±16.75歲。其中符合重癥CAP患者12例(13.79%)，非重癥CAP患者75例(86.21%)。其他臨床資料(見表1)。

表1 87例初治失敗CAP患者的臨床資料[n(%)]

二、標(biāo)本留取

所有患者于入院后常規(guī)留取痰液進行細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、抗酸染色、涂片檢查，并完善G實驗、GM實驗、肺炎支原體抗體、呼吸道8種病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等檢查。所有患者在初治失敗后行支氣管鏡檢查，并進行肺泡灌洗術(shù)，同時留取2份支氣管肺泡灌洗液(BALF)，一份送本院檢驗科進行傳統(tǒng)病原學(xué)檢查(細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、涂片、抗酸染色、GM實驗)，另一份外送華大基因公司進行病原菌高通量測序檢測。所有患者均簽署針對mNGS高額費用知情同意書。mNGS標(biāo)本的采集、保存和運輸嚴(yán)格按照公司標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范執(zhí)行。

三、臨床解讀

臨床醫(yī)生根據(jù)患者影像學(xué)、臨床表現(xiàn)、病情演變、前期抗菌藥物療效、血清病原學(xué)檢測結(jié)果及痰、肺泡灌洗液病原學(xué)檢測報告以及既往診治經(jīng)驗等綜合判斷患者肺部感染的相關(guān)致病病原體。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料以百分率表示(%)，病原mNGS與傳統(tǒng)檢測結(jié)果相比較采用配對χ2檢驗，兩種診斷結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、87例初治失敗CAP患者病原體陽性結(jié)果分布情況

1 75例非重癥CAP患者病原體分布情況 75例患者共分離到31種微生物，總株數(shù)為80，mNGS共檢出80株，傳統(tǒng)方法檢出6株，其中傳統(tǒng)方法檢測陽性患者使用mNGS方法均檢出同一種病原菌。在分離到的31種微生物中，細(xì)菌(32/80)感染最常見，細(xì)菌感染中最常見的為副流感嗜血桿菌(6/32)，其次為肺炎鏈球菌(5/32)、肺炎克雷伯菌(4/32)、流感嗜血桿菌(3/32)。其次為結(jié)核分支桿菌感染(20/80)，再次為真菌(11/80)及病毒(11/80)，真菌感染中白色念珠菌最常見(5/11)，病毒感染中巨細(xì)胞病毒最常見(5/11)。非典型病原體3株(鸚鵡熱衣原體1株，肺炎支原體1株，嗜肺軍團菌1株)，非結(jié)核分支桿菌2株(1株為鳥型分支桿菌復(fù)合群，1株為膿腫分支桿菌)(見表2)。

表2 75例初治失敗非重癥CAP患者病原體陽性結(jié)果分布[n(%)]

2 12例重癥CAP患者病原體分布情況 12例患者共分離到11種微生物，總株數(shù)為14，mNGS共檢出14株，傳統(tǒng)方法檢出1株，其中傳統(tǒng)方法檢測陽性患者使用mNGS方法均也出同一種病原菌。在分離到的14種微生物中，真菌感染最常見(6/14)，其中曲霉最常見(2/6)；其次為非典型病原體(4/14)，其中鸚鵡熱衣原體最常見(3/4);細(xì)菌感染2例，分別為黏液羅氏菌及溶血葡萄球菌；非結(jié)核分支桿菌及病毒各1例(見表3)。

表3 12例初治失敗重癥CAP患者病原體陽性結(jié)果分布[n(%)]

二、兩種方法病原體檢出種類比較

87例初治失敗的CAP患者中，74例(85.06%)患者mNGS結(jié)果為陽性，其中51例(58.62%)檢出一種致病菌，23例(2.00%)檢出兩種及以上病原菌(見表4)。

表4 兩種方法病原體檢出種類數(shù)比較[n(%)]

三、兩種方法陽性與陰性檢出結(jié)果比較

在87例患者支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)7例(8.05%)標(biāo)本為雙陽性，13例均為陰性(14.94%)，僅mNGS陽性為67例(77.01%)，兩種檢測方法差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表5)。

表5 兩種方法陽性與陰性檢出結(jié)果比較[n(%)]

四、87例初治失敗CAP患者轉(zhuǎn)歸情況

根據(jù)mNGS結(jié)果，及時調(diào)整治療方案，87例患者中共3例患者死亡，3例患者均因合并肺癌導(dǎo)致死亡。余患者均治療有效。

討 論

社區(qū)獲得性肺炎是呼吸系統(tǒng)常見疾病，發(fā)病率高，死亡率亦較高，2012年我國社區(qū)獲得性肺炎的平均死亡率為17.46/10萬。在初步診斷的CAP中，約11%～16%[4]的患者會出現(xiàn)初治失敗，這將增加患者的病死率。及時明確病原菌后，做到精準(zhǔn)治療，具有重要的臨床意義，可提高患者的治愈率，降低死亡風(fēng)險，減少抗生素的濫用。然而，在初治失敗的患者中，通過進一步的病原體檢測方法，仍有46.9%～55.0%患者不能明確病原體[5]，mNGS具有病原體陽性檢出率高、快速、病原體廣覆蓋、靈敏度高等特點，本研究對初治失敗的CAP患者送檢支氣管肺泡灌洗液的mNGS,結(jié)果顯示與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法相比，檢出的病原體種類更多，包括細(xì)菌、病毒、非典型病原體及結(jié)核，且檢出陽性率更高，高達85.06%，而傳統(tǒng)方法只有8.05%。

mNGS對送檢標(biāo)本中所在的病原體“一網(wǎng)打盡”，同時還可發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原體，如2019年年底發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒，宏基因組測序首先提出新型冠狀病毒致病原的信息，在病原體的確定中起到了重要作用。傳統(tǒng)檢測方法需要根據(jù)臨床醫(yī)生的經(jīng)驗，有針對性的選擇特定的病原體進行檢測，相對比較局限。

對于mNGS的檢測結(jié)果需要臨床醫(yī)生根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、前期的治療效果、流行病學(xué)、標(biāo)本的來源等綜合進行情況進行解讀。對于mNGS報告中序列數(shù)高的微生物并不一定是致病原，序列數(shù)低的的也不一定不是致病原，序列數(shù)受標(biāo)本中病原體數(shù)量、核酸的提取量、標(biāo)本中人源序列豐度等因素的影響。如血、胸水、腦脊液等無菌標(biāo)本受污染的可能性較小，測出的病原體為致病原的可能性較大，但痰、肺泡灌洗液中可能存在污染，本研究選取肺泡灌洗液作為送檢標(biāo)本，檢出了多種口腔定植菌及條件致病菌。但如果是嚴(yán)格的致病病原體，如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、曲霉菌等，即使序列數(shù)不高，也需考慮可能為致病菌。本研究中有患者mNGS報告中結(jié)核分枝桿菌的序列數(shù)為7，也判定為致病菌。87例初治失敗CAP患者，中有3例患者均因合并肺癌導(dǎo)致死亡，余患者根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整治療方案后癥狀均改善。

成人CAP常見的病原體包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、支原體、衣原體病毒等[6]。本研究結(jié)果顯示在初治失敗的非重癥CAP患者中，細(xì)菌感染最常見，其次為結(jié)核、真菌。細(xì)菌感染中最常見的細(xì)菌為副流感嗜血桿菌，其次為肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌。重癥CAP患者中真菌感染最常見，非典型病原體也較常見，特別是鸚鵡熱衣原體所占比例大。本研究中共確診鸚鵡熱衣原體肺炎4例，3例診斷為重癥CAP，提示鸚鵡熱衣原體易引起重癥肺炎，同時在治療重癥CAP患者時需考慮覆蓋非典型病原體。在2020年新型冠狀病毒肺炎疫情期間，本研究發(fā)現(xiàn)另一種非典型病原體鸚鵡熱衣原體感染CAP較以往呈上升趨勢，且易重癥化，需引起臨床重視。一項關(guān)于CAP患者中肺炎鏈球菌感染情況的系統(tǒng)分析，部分地區(qū)肺炎鏈球菌感染率在30%以上[7]。我國的一項全國多中心593例成人CAP調(diào)查中，肺炎鏈球菌感染率為13.3%，其次為流感嗜血桿菌及肺炎克雷伯桿菌[8]。相關(guān)研究[9]顯示非典型病原體在CAP病原體所占比例中逐漸升高，特別是在青壯年、無基礎(chǔ)疾病的患者中。但目前臨床上診斷非典型病原體檢測多依賴血清學(xué)抗體檢測，直接培養(yǎng)較為困難，本研究顯示NGS為非典型病原體的診斷提供了更為準(zhǔn)確的方法。隨著近年來的SARS、高致性禽流感H5N1、甲型H1N1l流感病毒及2019年新型冠狀病毒的爆發(fā)流行及檢測技術(shù)的進步，病毒在CAP病原體中的作用越來越重要。一項基于28項臨床研究的meta分析顯示，在歐洲地區(qū)，病毒感染占CAP致病原的22%左右，其中流感病毒是最常見的病毒[10]。本研究檢測出12株病毒感染，其中巨細(xì)胞病毒及EB病毒較多見，可能與本研究所針對的患者為初治失敗的患者，且部分患者僅進行DNA病原體檢測有關(guān)，且病毒的檢測可能受其流行季節(jié)等多種因素影響，病毒檢出率以及每種病毒所占比例會有所差異。

與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測方法相比，mNGS雖然存在許多優(yōu)勢，但也存在一些局限性，如對檢出的微生物難以區(qū)分感染、污染還是定植；對于胞內(nèi)菌(如結(jié)核分支桿菌)、真菌及RNA病毒檢測的敏感度較低；缺乏統(tǒng)一完善的檢測流程及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[10]；檢測費用較高等。

本研究也存在不足之處，(1)研究樣本數(shù)量有限，需擴大樣本量進一步統(tǒng)計分析；(2)本研究為回顧性研究，未進行mNGS檢測靈敏度及特異度統(tǒng)計分析，對于mNGS的結(jié)果的判定可能存在一定的偏差；(3)檢測標(biāo)本送檢院外實驗室，非本院檢驗科微生物室檢測。

臨床上如遇到初治失敗的CAP患者，特別是針對危重癥患者，可盡早完善mNGS檢測，進行精準(zhǔn)治療，減少不適當(dāng)抗生素的使用及濫用，做到精準(zhǔn)治療及精確診斷。