張冠磊 馬苗苗 蘭文靜 梁軍

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是臨床呼吸內(nèi)科常見病，以慢性咳嗽、氣短、呼吸困難、喘息、胸悶為常見臨床表現(xiàn)，可最終發(fā)展為呼吸衰竭，對患者生命健康及生活質(zhì)量均造成嚴重影響[1-2]。有害氣體及有害顆粒引發(fā)的呼吸道異常炎癥反應(yīng)繼發(fā)氣道重塑是COPD的重要病理特征[3]。因此抑制氣道重塑，改善氣道正常結(jié)構(gòu)和功能是臨床治療目標。細胞增殖抑制基因(hyperplasic suppress gene，HSG)又被稱為線粒體融合蛋白2(mitofusion2，Mfn2)，是具有抑制細胞增殖作用的基因。研究發(fā)現(xiàn)[4]，HSG可抑制血管平滑肌細胞、心臟成纖維細胞、惡性腫瘤細胞等多種細胞的增殖，且在COPD小鼠模型肺組織中低表達，故猜測HSG參與COPD氣道重塑。本研究通過建立COPD大鼠模型，探討HSG過表達在COPD大鼠氣道重建的作用及對Wnt/PCP通路的影響，以期為COPD的基因靶點治療研究提供參考。

資料與方法

一、實驗動物

50只8周齡SPF級雄性SD大鼠[北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2017-0006]，體質(zhì)量(200±20)g。自由進水飲食，動物房清潔通風(fēng)，溫度(23±2) ℃，濕度(50±10)%，12 h晝夜節(jié)律，自由進食、進水。

二、藥物、儀器與試劑

攜帶目的基因的RNA-HSG慢病毒、空載慢病毒(上海和元生物技術(shù)股份有限公司)，SP600125[c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抑制劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma公司)、紅旗渠牌烤煙型香煙(河南安陽卷煙廠，焦油量10 mg，煙氣煙堿量1 mg，煙氣一氧化碳量11 mg)，兔抗大鼠HSG、Wnt7a、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、RhoA、波形蛋白抗體，磷酸化(phosphorylation，p)-JNK抗體(美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(上海玉博生物科技有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司)，動物呼吸機(北京慧榮和科技有限公司)，PCR儀、Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，RM2235石蠟切片機、DM500雙目生物顯微鏡(德國Leica)。

三、大鼠模型制備與分組

根據(jù)參考文獻[5]，第1天、第14天每只大鼠分別經(jīng)氣道滴入LPS 200 μg，第2～28天(氣道滴入LPS當(dāng)天不煙熏)將大鼠置于玻璃熏煙染毒箱內(nèi)，香煙點燃后放入自制煙熏裝置中，以打氣筒將煙霧注入染毒箱內(nèi)，頻率為5 min/支，40 min(8支)/次，2次/d，4 h/次，連續(xù)6 d間隔1 d。

50只大鼠隨機選取40只建立COPD模型，分為模型組、過表達組、空載組、Wnt/PCP抑制組，每組10只。剩余10只為對照組，以相同方法氣道內(nèi)滴入生理鹽水，無煙熏。過表達組、空載組在煙熏第16天分別以HSG過表達慢病毒顆粒、空載體慢病毒顆粒經(jīng)尾靜脈注射2 mL/kg，3天1次，至建模結(jié)束，Wnt/PCP抑制組同法注射SP600125 2 mL/kg，對照組和模型組則予以注射等量生理鹽水。

四、大鼠肺功能測定

建模結(jié)束后第2天各組大鼠以3%戊巴比妥鈉(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺，做頸部切口，逐層分離暴露氣管，于環(huán)狀軟骨上做一倒“T”型切口，氣管插管后將大鼠置入體描箱內(nèi)，封閉體描箱，氣管插管一端鏈接體描箱上動物呼吸機的三通管，描記一段平靜呼吸后設(shè)置用力肺活量(FVC)控制器，用呼吸機向?qū)嶒瀯游镙斎朐O(shè)定的FVC以模擬用力吸氣，經(jīng)負壓系統(tǒng)模擬用力呼氣過程，為1次肺功能過程，使大鼠保持平靜呼吸20 s后進行下一次測定，檢測氣道阻力、肺順應(yīng)性、最大呼氣流量(peak expiratory flow，PEF)，每個大鼠至少測量5次，取平均值。

五、大鼠肺組織取材及保存

肺功能測定后股動脈放血處死大鼠，取出氣管和肺組織，剝離氣管，分離小支氣管用于成纖維細胞制備及鑒定。左肺組織置以4%多聚甲醛固定，行HE病理觀察，右肺組織以生理鹽水灌洗，收集灌洗液。

六、ELISA檢測肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中PDGF、TGF-β1、MMP-9水平

灌洗液4 ℃條件下以3500 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上層清液，保存于-20 ℃待檢。按照ELISA試劑盒說明書操作，標準品、對照品各50 μL，ELISA分別加入50 μL孵育緩沖液，加入50 μL生物素化連接物37 ℃孵育2 h，吸入多余液體，PBS洗滌，加入100 μL親和素標記的HRP，室溫孵育0.5 h，加入終止液100 μL，以酶標儀測定450 nm處吸光度值，根據(jù)標準曲線計算PDGF、TGF-β1、MMP-9濃度。

七、HE染色觀察肺組織病理變化

肺組織置于4%多聚甲醛固定24 h，脫水、包埋、切片(3 μm)，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

八、成纖維細胞制備及鑒定

小支氣管置于雙抗溶液中，剪碎后置于細胞培養(yǎng)瓶底，加入2 mL 20% DMEM溶液，于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第3代成纖維細胞制成細胞爬片，置于無菌六孔板中，密度為3×104個細胞/L，5天后取出，PBS洗滌，多聚甲醛浸泡固定，PBS洗滌，加入Ⅰ抗波形蛋白(1 ∶150)、Ⅱ抗波形蛋白(1 ∶150)，DAPi復(fù)染核，顯微鏡下觀察、鑒定。

九、實時熒光定量PCR檢測檢測成纖維細胞HSG、Wnt7a、RhoA、JNK mRNA表達情況

取各組對數(shù)生長期細胞接種于六孔板中，去除各孔培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS沖洗3遍，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以實時熒光定量PCR檢測各組HSG、Wnt7a、RhoA、JNK mRNA表達水平，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性8 min，95 ℃變性45 s，59 ℃退火50 s，73 ℃延伸1 mins，反應(yīng)35個循環(huán)，再次72 ℃延伸5 min，以β-actin為管家基因，2-ΔΔCt為目的基因的相對表達，取3次檢測結(jié)果的平均值(引物序列見表1)。

表1 引物序列

十、Western blot檢測成纖維細胞HSG、Wnt7a、JNK、Rho蛋白表達情況

取各組對數(shù)生長期細胞，細胞裂解液收集各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白總量，SDS-PAGE凝膠電泳，SDS-PAGE電泳分離蛋白，洗膜后置于5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)觀察，Image J分析灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值為目的蛋白相對表達水平。

十一、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組大鼠肺功能比較

與對照組比較，模型組、過表達組、空載組、Wnt/PCP抑制組氣道阻力增加，肺順應(yīng)性、PEF下降(P<0.05)；與模型組和空載組比較，過表達組與Wnt/PCP抑制組氣道阻力減小，肺順應(yīng)性、PEF升高(P<0.05)；模型組與空載組、過表達組與Wnt/PCP抑制組的氣道阻力、肺順應(yīng)性、PEF比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組肺功能比較

二、各組BALF中PDGF、TGF-β1、MMP-9水平比較

與對照組比較，模型組、過表達組、空載組、Wnt/PCP抑制組PDGF、TGF-β1、MMP-9水平升高(P<0.05)；與模型組和空載組比較，過表達組和Wnt/PCP抑制組PDGF、TGF-β1、MMP-9水平降低(P<0.05)；模型組與空載組、過表達組與Wnt/PCP抑制組PDGF、TGF-β1、MMP-9水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組BLAF中PDGF、TGF-β1、MMP-9水平比較

三、大鼠肺組織病理學(xué)觀察

對照組大鼠支氣管黏膜上皮完整，纖毛柱狀排列整齊，無明顯上皮細胞壞死脫落，極少見杯狀細胞，黏膜下腺體無增生、肥大；模型組中支氣管柱狀上皮脫落，纖毛倒伏、粘連，黏膜下腺體增生、肥大，杯狀細胞增生，支氣管壁及支氣管周圍可見中性粒細胞、漿細胞、淋巴細胞等大量炎癥細胞浸潤；過表達組可見氣道上皮細胞脫落，纖毛粘連，杯狀細胞增多，炎癥細胞浸潤，病理改變較模型組輕；空載組病理變化與模型組相同；Wnt/PCP抑制組病理變化與過表達組相當(dāng)(見圖1)。

圖1 HE染色觀察各組大鼠病理學(xué)形態(tài)變化(HE×200)

四、各組成纖維細胞形態(tài)觀察及鑒定

純化后的成纖維細胞以梭形為主，免疫組化進行成纖維細胞鑒定，經(jīng)波形蛋白染色后，倒置顯微鏡下觀察波形蛋白鑒定陽性，細胞胞質(zhì)呈棕色改變，周邊顏色變淺(見圖2)。

圖2 純化后的成纖維細胞及波形蛋白鑒定

五、成纖維細胞中HSG、Wnt7a、RhoA、JNK mRNA相對表達量比較

與對照組比較，模型組、空載組、Wnt/PCP抑制組成纖維細胞中HSG mRNA相對表達量降低，過表達組HSG mRNA相對表達量升高(P<0.05)；與模型組、空載組、Wnt/PCP抑制組比較，過表達組HSG mRNA相對表達量升高(P<0.05)，模型組、空載組、Wnt/PCP抑制組HSG mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組、過表達組、空載組Wnt7a、RhoA mRNA相對表達量升高，Wnt/PCP抑制組Wnt7a、RhoA mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與模型組和空載組比較，過表達組、Wnt/PCP抑制組Wnt7a、RhoA mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與過表達組比較，Wnt/PCP抑制組Wnt7a、RhoA mRNA相對表達量降低(P<0.05)；模型組和空載組Wnt7a、RhoA mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。JNK mRNA相對表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

圖3 成纖維細胞HSG、Wnt7a、RhoA、JNK mRNA相對表達量比較

六、成纖維細胞中HSG、Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量及p-JNK/JNK比較

與對照組比較，模型組、空載組、Wnt/PCP抑制組HSG蛋白相對表達量降低，過表達組HSG蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與模型組、空載組、Wnt/PCP抑制組比較，過表達組HSG蛋白相對表達量升高(P<0.05)；模型組、空載組、Wnt/PCP抑制組HSG蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組、過表達組、空載組Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量及p-JNK/JNK升高，Wnt/PCP抑制組Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量及p-JNK/JNK更高更低(P<0.05)；與模型組和空載組比較，過表達組、Wnt/PCP抑制組Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量及p-JNK/JNK降低(P<0.05)；與過表達組比較，Wnt/PCP抑制組Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量及p-JNK/JNK降低(P<0.05)；模型組與空載組HSG、Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖4～5)。

圖4 成纖維細胞HSG、Wnt7a、RhoA蛋白相對表達量及p-JNK/JNK比較

圖5 Western blot檢測各組蛋白表達情況

討 論

COPD的發(fā)病機制與氣道炎癥、氧化應(yīng)激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡及肺氣腫有關(guān)，其病理發(fā)展為各種因素導(dǎo)致大量炎癥因子被釋放，炎癥細胞發(fā)生趨化、粘附、遷移聚集于氣道內(nèi)，長期反復(fù)的炎癥導(dǎo)致氣道重塑，小氣道阻力增加，呼吸功能和肺功能持續(xù)下降，并出現(xiàn)各種心肺并發(fā)癥，影響患者的日常生活，具有較高的致殘、致死率[6-7]。氣道重塑是COPD重要病理特征，而成纖維細胞增殖是氣道重塑的病理表現(xiàn)[8]。研究顯示[9]，成纖維細胞的增殖活躍可導(dǎo)致氣道壁增厚纖維化，另因成纖維細胞增多、活躍，且粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，大量膠原沉積于成纖維細胞周圍，可刺激成纖維細胞的增生，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致氣道重塑。因此，抑制氣道重塑是治療COPD的重要原則。

本研究結(jié)果中，與模型組和空載組比較，過表達組氣道阻力減小，肺順應(yīng)性、PEF升高，BALF中PDGF、TGF-β1、MMP-9水平降低；病理組織觀察顯示，模型組支氣管柱狀上皮脫落，黏膜下腺體增生、肥大，有大量炎癥細胞浸潤，過表達組病理改變較模型組輕，與模型組、空載組和Wnt/PCP抑制組比較，過表達組成纖維細胞中HSG mRNA與蛋白相對表達量更高，提示HSG過表達可延緩COPD肺功能下降，減輕病理變化，抑制氣道重建。HSG是我國學(xué)者陳光慧利用差異顯示技術(shù)得到的新基因，其編碼產(chǎn)物HSG/Mfn2可抑制細胞增殖，并與平滑肌α肌動蛋白相互作用影響血管平滑肌細胞的分化[10]。另外，HSG/Mfn2還能促進線粒體融合，影響線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能[11]。趙克蟬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HSG在急性COPD患者中的表達水平低于正常人，且參與氣道重建，與本研究觀點一致。PDGF屬于血管生成因子，能調(diào)控成纖維細胞功能，促進成纖維細胞的增殖；TGF-β1具有調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、分化作用；MMP-9是與氣道重建密切相關(guān)的蛋白酶，主要作用是降解、重塑細胞外基質(zhì)，能促進氣道纖維化參與氣道重建[13-14]。Herrmann等研究[15]認為TGF-β1、MMP-9、PDGF的過表達可誘導(dǎo)成纖維細胞的活化，促進肺纖維化。以上分析與研究結(jié)果說明，HSG過表達可抑制COPD氣道重建。

Wnt通路是控制發(fā)育的重要通路，根據(jù)其信號蛋白傳遞方式不同，可分為不同途徑，其中Wnt/PCP途徑(又稱Wnt/JNK途徑)是細胞平面極性途徑，可通過重排細胞骨架調(diào)控細胞極性[16]。在PCP途徑中，Wnt7a與卷曲蛋白受體蛋白結(jié)合后可激活蓬亂蛋白下游區(qū)，繼而激活Rho家族的GTP酶，GTP酶可引起JNK的磷酸化從而調(diào)節(jié)細胞極性，影響細胞的增殖、遷移[17]。JNK是哺乳類細胞中MAPK信號通路的亞類，可通過磷酸化激活NF-κB，啟動與應(yīng)激相關(guān)的炎癥介質(zhì)的合成，參與細胞應(yīng)激、凋亡及纖維化的進程[18]。王成澤證實舌鱗狀細胞癌的增殖、遷移與侵襲與Wnt/PCP信號通路的激活有關(guān)[19]。程健等證實[20]，抑制JNK通路的表達可抑制放射性肺炎小鼠的肺組織損傷并減輕炎癥程度。本研究結(jié)果中，與模型組比較，Wnt/PCP抑制組氣道阻力減小，肺順應(yīng)性、PEF升高，PDGF、TGF-β1、MMP-9水平均降低，且與過表達組無統(tǒng)計學(xué)差異，肺組織病理學(xué)變化與過表達組相當(dāng)；Wnt/PCP抑制組和過表達組成纖維細胞中Wnt7a、RhoA mRNA和蛋白相對表達量及p-JNK/JNK均低于模型組與空載組，且Wnt/PCP抑制組低于過表達組，說明抑制Wnt/PCP通路的激活可抑制肺功能下降，減輕肺組織病變，抑制氣道重塑。

綜上所述，HSG過表達可改善COPD大鼠肺功能，延緩病理變化，抑制氣道重塑，其機制可能與抑制Wnt/PCP通路的激活有關(guān)。今后可考慮將HSG作為COPD基因靶向治療的切入點。