施 瑜，王 震，張漢園，李 瑩

江蘇省鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212000

肺炎克雷伯菌(KPN)是人和動(dòng)物消化道及呼吸道的正常菌群，也是臨床重要的機(jī)會(huì)致病菌。近3年來(lái)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示，KPN已經(jīng)成為臨床占比第二位的致病菌，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在腸桿菌科中為最高，在25.00%以上[1-3]。根據(jù)KPN在瓊脂平板上的黏液性質(zhì)可分為經(jīng)典型肺炎克雷伯菌(cKP)和高黏液肺炎克雷伯菌(HvKP)，HvKP因其攜帶更多的毒力基因，具有比cKP更高的毒力，往往會(huì)引起較為嚴(yán)重的肺炎、敗血癥、眼內(nèi)炎、壞死性筋膜炎和各臟器的膿腫等多部位的感染，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[4-5]，呈現(xiàn)出高毒力、高致病的特性。KPN的毒力因子包括莢膜多糖抗原、鐵攝入系統(tǒng)，菌毛的黏附作用等，包括有rmpA、magA、wcaG、fimH、kfu、Aero等毒力基因，這些毒力基因的表達(dá)都大大增加了KPN的侵襲力。本次研究重點(diǎn)對(duì)本院2019年1-9月臨床分離的KPN的黏液表型、莢膜血清型、毒力基因和耐藥性的相互關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集本院2019年1-9月臨床分離的非重復(fù)菌株。所有菌株均經(jīng)珠海迪爾的DL-96Ⅱ細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定為KPN，菌種保存于-80 ℃超低溫醫(yī)用冰箱中。藥敏結(jié)果參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)提供的(M100-S28)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判讀。

1.2儀器與試劑 3110型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，-80 ℃超低溫醫(yī)用冰箱(海爾公司)、高速低溫離心機(jī)(湖南湘儀公司)，金屬干式加熱儀(Labnet公司)，mini 1610 PCR擴(kuò)增儀(杭州朗基公司)，EPS-600電泳儀(上海天能公司)，紫外線凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；哥倫比亞血平板和中國(guó)藍(lán)平板(上海科瑪嘉公司)，Premix TaqTM Version 2.0 plus dye、DL2000 DNA標(biāo)志物、瓊脂糖均購(gòu)自日本Taraka公司，GoldviewⅠ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株復(fù)蘇、轉(zhuǎn)種、分純和鑒定 將保存于-80 ℃超低溫冰箱的菌種復(fù)蘇，轉(zhuǎn)種于血平板，35 ℃培養(yǎng)18 h，挑取血平板上單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，分純后的菌落經(jīng)DL-96Ⅱ細(xì)菌鑒定儀鑒定為KPN，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。所有鑒定均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第四版操作。

1.3.2質(zhì)控菌株 大腸埃希菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603) 均購(gòu)自江蘇省臨床檢驗(yàn)中心。

1.3.3黏液絲試驗(yàn)(ST) 用接種環(huán)蘸取菌落向上挑起，重復(fù)兩次。如黏液絲不能挑起或長(zhǎng)度小于5 mm，判定為ST陰性；如黏液絲長(zhǎng)度等于或超過(guò)5 mm則判定為ST陽(yáng)性，即高黏液表型菌(HvKP)[6]。

1.3.4DNA模板制備 1.5 mL的EP管中加入400 μL SDS裂解液，用接種環(huán)挑取適量菌落于裂解液中混勻。置于金屬干式加熱儀中100 ℃加熱20 min，12 000 r/min,4 ℃高速離心10 min，上清液即為DNA模板，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5莢膜血清型和毒力基因檢測(cè) 采用PCR法擴(kuò)增K1、K2、K5、K20、K54、K57 6種主要莢膜血清型和rmpA、magA、wcaG、fimH、kfu、Aero 6種毒力基因。引物委托寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL：Premix Taq plus酶25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 18 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃，預(yù)變性3 min、94 ℃變性40 s、50～59 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s、經(jīng)35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。引物序列參考文獻(xiàn)[6-9]、退火溫度和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.50%瓊脂糖凝膠電泳120 V 80 min，在紫外凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

表1 KPN的莢膜血清型和毒力基因引物序列

續(xù)表1 KPN的莢膜血清型和毒力基因引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Whonet 5.6軟件對(duì)細(xì)菌耐藥進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用菌株數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1莢膜血清型和毒力基因分布 93株KPN中6種莢膜血清型和6種毒力基因均有檢出。其中K2型檢出率最高，為21.50%(20/93)，其次是K1型占13.98%(13/93)，K57型占8.60%(8/93)，K20型和K54型均占3.24%(3/93)，K5型占1.08%(1/93)。毒力基因中fimH占比最高，為96.80%(90/93)；其次是rmpA和Aero，均為64.52%(60/93)；magA僅在K1型中檢出；wcaG僅在K1和K54型中檢出。同時(shí)檢測(cè)到6種毒力基因的KPN菌株為13.98%(13/93)，全部出現(xiàn)在K1型中；同時(shí)檢出4種和3種毒力基因的分別為11.83%(11/93)和33.33%(31/93)，主要見(jiàn)于K2、K20、K54、K57型中；rmpA+fimH+Aero的組合最為多見(jiàn)，占33.33%(31/93)，有22株KPN只檢出1種毒力基因fimH。有2株KPN未檢測(cè)到上述6種莢膜血清型和6個(gè)毒力基因。見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖1。

表2 93株KPN的莢膜血清型和毒力基因的檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.2不同黏液表型KPN的莢膜血清型與毒力基因比較 ST陽(yáng)性株，即HvKP占51株(54.84%)，6種莢膜血清型在HvKP中均有檢出，為78.43%(40/51)；ST陰性株(cKP)為42株(45.16%)，除了K5和K57型，其余4種血清型在cKP中均有檢出，為19.05%(8/42)，主要莢膜血清型在不同黏液表型的檢出率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。毒力基因rmpA、wcaG和Aero在HvKP的檢出率明顯高于cKP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，magA、fimH和kfu在二者的構(gòu)成比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HvKP中同時(shí)攜帶3種以上毒力基因者為86.27%(44/51)，高于cKP的26.19%(11/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同黏液表型KPN的莢膜血清型與毒力基因檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.3不同黏液表型菌的藥敏比較 除氨芐西林對(duì)KPN的耐藥率為100.00%外，HvKP對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥率均低于cKP，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)亞胺培南、美羅培南、派拉西林/他唑巴坦、慶大霉素和阿米卡星耐藥的菌株。除亞胺培南和美羅培南外，其他12種常見(jiàn)抗菌藥物在兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

注：M為DL2000 DNA標(biāo)志物；1～6泳道分別為K1、K2、K5、K20、K54、K57血清型，片段長(zhǎng)度分別是1 283、641、280、741、881、1 037 bp；7～12泳道分別是毒力基因wcaG、fimH、kfu、magA、rmpA和Aero，片段長(zhǎng)度分別是169、688、797、1 283、536、556 bp。

表4 不同黏液表型KPN對(duì)抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]

續(xù)表4 不同黏液表型KPN對(duì)抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]

2.4多重耐藥菌與黏液表型、莢膜血清型和毒力基因的相關(guān)性比較 93株KPN中，檢出20株多重耐藥菌，其中產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLS)的KPN 18株(19.35%)，耐碳青霉烯類抗菌藥物的KPN 2株(2.15%)，多重耐藥菌在黏液表型、主要莢膜血清型、rmpA、magA、wcaG、Aero的檢出率均明顯高于耐藥菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 耐藥菌與敏感菌的莢膜血清型和毒力基因比較[n(%)]

3 討 論

自從20世紀(jì)80年代臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道了可引起多處非傳統(tǒng)部位感染的HvKP以來(lái)[10]，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)HvKP相較cKP而言，其細(xì)菌的黏液表型特征、致病特點(diǎn)都有很大的差異[11]。其主要特征是可引起健康人群、沒(méi)有基礎(chǔ)疾病的亞太人群的感染，同時(shí)具有從原始感染部位轉(zhuǎn)移至其他組織器官，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)端、不常見(jiàn)部位如眼和軟組織等處的感染，這在非免疫缺陷患者革蘭陰性桿菌的感染中非常罕見(jiàn)[12]。本次研究中，HvKP占54.85%，cKP占45.16%，本次分離的KPN以高黏液表型為主。

莢膜多糖(CPS)被認(rèn)為是KPN最重要的毒力因子之一，CPS親水并帶有負(fù)電荷，與同樣帶有負(fù)電荷的吞噬細(xì)胞之間存在靜電相斥現(xiàn)象，可以阻滯和抵抗宿主吞噬細(xì)胞的吞噬和消化作用。根據(jù)CPS抗原的不同，可將KPN分為82個(gè)血清型[13]，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57型莢膜血清型與HvKP密切相關(guān)，是最常見(jiàn)的、毒力最強(qiáng)的型別，具有更強(qiáng)的致病性[14]。本次研究中6種莢膜血清型都有檢出，其中以K2型為主(21.50%)，其次是K1型(13.98%)和K57型(8.60%)。K1/K2/K57型在HvKP的檢出率(70.59%)明顯高于cKP(11.90%)，K57型只出現(xiàn)在HvKP中，與上海地區(qū)相似[15]。雖然K1/K2型主要見(jiàn)于高黏液表型中，但是在非黏液表型也有少量檢出，所以僅僅通過(guò)ST試驗(yàn)可能會(huì)漏檢高產(chǎn)毒菌株，檢測(cè)人員需要通過(guò)PCR檢測(cè)莢膜血清型和毒力基因才能更好地篩選出產(chǎn)毒菌株。

6種毒力基因在13株K1型菌中全部都有檢出；其他5個(gè)型別同時(shí)攜帶3～4種毒力基因者(82.86%)明顯高于未分型者(30.95%)；HvKP組中同時(shí)攜帶3種以上毒力基因者(86.27%)明顯高于cKP組(30.95%)。此次研究證實(shí)了高毒力血清型攜帶有更多的毒力基因；K1型毒力相較其他莢膜血清型而言，毒力更強(qiáng)。攜帶有多種毒力基因的K1型與侵襲性綜合征(尤其在肝膿腫)密切相關(guān)[10]，實(shí)驗(yàn)室需要加強(qiáng)對(duì)K1型KPN的監(jiān)控。

本次研究發(fā)現(xiàn)，fimH在6種毒力基因中的檢出率最高，為 96.80%；其次是rmpA和Aero，均為64.52%，magA檢出率最低。fimH主要編碼Ⅰ型菌毛(TIP)蛋白[16]，fimH主要介導(dǎo)細(xì)菌的TIP與上皮細(xì)胞的甘露糖受體結(jié)合，使KPN黏附于宿主細(xì)胞上，同時(shí)還介導(dǎo)生成生物膜[17]，因?yàn)椴粎⑴c黏液的形成，所以在HvKP株(98.04%)和cKP株(96.24%)的分布沒(méi)有差異，與相關(guān)報(bào)道一致[18]。rmpA作為黏液表型調(diào)節(jié)基因，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，在多種莢膜血清型的合成中起到正向調(diào)控作用[15]，形成高黏液表型，rmpA基因存在于219×103大質(zhì)粒上，CHEN等[19]發(fā)現(xiàn)該毒力質(zhì)粒上還同時(shí)表達(dá)包括Aero在內(nèi)的多種毒力基因，HvkP株含有此毒力質(zhì)粒，可協(xié)同調(diào)控HvKP毒力的形成，增加KPN的侵襲力；Aero編碼的是鐵載體中最為重要的氣桿菌素，可與宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白中Fe3+結(jié)合形成螯合物，通過(guò)細(xì)胞膜上特定的鐵蛋白受體進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，從而干擾宿主體內(nèi)的鐵代謝，此外鐵載體還可以催化產(chǎn)生自由基，造成宿主組織細(xì)胞的損傷[20]。本次研究發(fā)現(xiàn)，所有rmpA陽(yáng)性的菌株Aero也同時(shí)陽(yáng)性，在HvKP株的檢出率(96.08%)明顯高于在cKP中的檢出率(26.19%)，在6種血清型的檢出率(95.83%)明顯高于非分型組(31.11%)，提示rmpA和Aero是KPN的主要毒力基因。magA是黏液相關(guān)基因，僅存在于K1型的質(zhì)粒上，編碼K1型特異性的Wzy聚合酶[21]，是K1型莢膜生成的主要調(diào)控因子；wcaG編碼的基因產(chǎn)物是CPS中的巖藻糖，ZHENG等[22]發(fā)現(xiàn)wcaG不僅參與CPS的合成，還是KPN形成生物膜的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本次研究發(fā)現(xiàn)，magA基因僅存在于K1型菌，證實(shí)了K1型和magA具有相關(guān)性，而wcaG基因只存在于K1和K54型中，與報(bào)道一致[23]。kfu編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的一些成分，有助于KPN攝入Fe3+，增強(qiáng)了KPN毒力[24]。

細(xì)菌耐藥方面，除了氨芐西林、亞胺培南和美羅培南的耐藥率在兩組KPN無(wú)差異外，HvKP的耐藥率明顯低于cKP。除了對(duì)氨芐西林的耐藥率為100.00%外，HvKP對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均較低，僅有1株HvKP產(chǎn)ESBLS，這株產(chǎn)ESBLS的HvKP為K2型，毒力基因的模式是rmpA+fimH+Aero。cKP中產(chǎn)ESBLS的檢出率為40.47%，只有1株為K20型，其余為未分型血清型，大多數(shù)只檢出1種毒力基因fimH；cKP中檢出2株CRE，均為未分型血清型，毒力基因的模式均為fimH+kfu。劉盼盼[25]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)亞胺培南體外誘導(dǎo)HvKP產(chǎn)生耐藥后，其高黏液表型消失、rmpA等毒力基因丟失、小鼠致死率下降、大多數(shù)毒力基因表達(dá)下調(diào)。本次研究中，多重耐藥菌的莢膜血清型的檢出率明顯低于敏感菌，除了fimH和kfu，其余4種毒力基因均存在明顯差異，究其原因，可能是KPN在獲得耐藥基因的同時(shí)丟失了質(zhì)粒上的毒力基因，導(dǎo)致毒力基因的表達(dá)發(fā)生改變，從而引起表型和毒力的變異。

綜上所述，本次研究的KPN以HvKP為主，K1、 K2和K57型是本院常見(jiàn)的莢膜血清型，K1型所攜帶的毒力基因最多；rmpA和Aero是KPN的主要毒力基因；HvKP攜帶的莢膜血清型和毒力基因均明顯高于cKP，但是耐藥率明顯低于cKP。本次研究還發(fā)現(xiàn)了1株產(chǎn)ESBLS的高產(chǎn)毒菌，這種高產(chǎn)毒多重耐藥菌一旦侵入機(jī)體將會(huì)為臨床的治療帶來(lái)極大地挑戰(zhàn)，因此必須引起高度重視，應(yīng)深入對(duì)此類菌株研究。