陳 嫣，胡 萃，歐陽佩琳

湖南省婦幼保健院婦產(chǎn)科，湖南長沙 410008

我國每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬例，該病呈年輕化趨勢[1-2]。因此，探究宮頸癌分子生物學機制，明確臨床診療靶點意義重大。miRNA為一類非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達[3]。臨床研究顯示，miRNA可通過影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移等參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且其在宮頸癌等多種腫瘤組織中表達異常[4]。本研究組前期利用芯片技術(shù)檢測了宮頸癌細胞培養(yǎng)的腫瘤球與貼壁細胞差異表達的miRNA，其中，miR-181a-5p差異表達較明顯，且腫瘤球中miR-181a-5p表達下調(diào)。因此，為進一步探究miR-181a-5p在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究對110例宮頸癌患者進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年10月本院收治的宮頸癌患者110例為宮頸癌組，年齡39～74歲，平均(56.49±8.26)歲。納入標準：(1)均為初發(fā)病例；(2)均接受手術(shù)治療且經(jīng)病理確診：(3)術(shù)前未接受放化療等治療。排除標準：排除合并嚴重感染性疾病、嚴重心肝腎等功能障礙者。另選取100例本院的體檢健康女性為對照組，年齡36～71歲，平均(57.86±7.41)歲。本研究經(jīng)本院倫理學委員會審批，入組對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集 收集宮頸癌患者術(shù)中癌組織及對應癌旁組織，經(jīng)液氮冷凍處理后，保存于-80 ℃冰箱待檢。采集空腹靜脈血4 mL，1 500 r/min離心10 min后，留取血清保存于-80 ℃冰箱待檢，宮頸癌患者于術(shù)前采集，對照組于體檢當日采集。

1.2.2總RNA提取 取組織標本100 mg及血清標本400 μL，組織標本先經(jīng)超聲勻漿，應用RNA提取試劑盒(購自杭州新景生物公司)分別提取組織標本和血清標本中總RNA，經(jīng)DEPC水溶解，應用南京菲勒公司生產(chǎn)的分光光度計測定RNA的濃度和純度。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海聯(lián)邁生物公司)說明書進行操作，將組織標本及血清標本中miR-181a-5p反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系如下：總RNA樣品2 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、上下游引物各1 μL、核糖核酸酶抑制劑0.5 μL、5倍緩沖液4 μL、dNTPs混合物(10 mmol/L)1 μL，加入RNase Free H2O補至20 μL。反應條件：16 ℃ 15 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min，產(chǎn)物置于4 ℃保存。

1.2.4PCR擴增反應 應用LEPGEN-96實時熒光定量PCR儀(購自北京樂普醫(yī)療科技公司)，按照PCR試劑盒(購自上海聯(lián)邁生物公司)說明書操作，反應體系如下：已稀釋的cDNA 2 μL、上下游引物各2 μL、SYBR GREENⅠ熒光染料12.5 μL，加雙蒸水補至20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)，95 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，35個循環(huán)。miR-181a-5p及內(nèi)參U6引物委托上海生工生物公司合成。miR-181a-5p上游引物序列：5′-TGAGGGCTAGAGACAAGCAG-3′，下游引物序列：5′-GTCAAGTGCACACGCGTGAC-3′；U6上游引物序列：5′-CGAGCGTTGACTCACCGTCA-3′，下游引物序列：5′-ACCTGTATTCTCGTGCTCAT-3′。應用公式2-ΔΔCt計算組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1組織標本及血清標本中miR-181a-5p的表達分析 宮頸癌患者癌組織中miR-181a-5p的相對表達水平為9.41±2.38，明顯低于癌旁組織的17.62±3.54，差異有統(tǒng)計學意義(t=20.198，P<0.05)，見圖1。宮頸癌組血清中miR-181a-5p的相對表達水平為11.03±2.76，明顯低于對照組的18.96±4.13，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.492，P<0.05)，見圖2。

圖1 組織標本中miR-181a-5p的相對表達水平

圖2 血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平

2.2miR-181a-5p的表達與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系 不同分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期的宮頸癌患者癌組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同年齡、不同腫瘤最大徑、是否絕經(jīng)、不同病理分型的宮頸癌患者癌組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 miR-181a-5p的相對表達水平與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3miR-181a-5p診斷宮頸癌的ROC曲線分析 癌組織中miR-181a-5p診斷宮頸癌的曲線下面積(AUC)為0.871(95%CI0.745～0.983，P<0.05)，靈敏度為94.42%，特異度為85.39%；血清中miR-181a-5p診斷宮頸癌的AUC為0.752(95%CI0.703～0.914，P<0.05)，靈敏度為89.19%，特異度為79.82%，見圖3。

圖3 miR-181a-5p診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討 論

宮頸癌為臨床常見惡性腫瘤，既往研究顯示，我國宮頸癌患者術(shù)后復發(fā)率和病死率較高[5]。因此，明確宮頸癌的早期診療靶標，探究其分子生物學機制意義重大。

miR-181a-5p為miR-181家族成員之一，其家族成員還包括miR-181a、miR-181b等序列，其中miR-181a-5p為成熟序列，已確定的靶標較多，如OPN、K-ras、SHP2等[6]。既往研究顯示，miR-181a-5p與乳腺癌[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]等腫瘤密切相關(guān)，其在不同癌組織中表達異常。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，宮頸癌癌組織中miR-181a-5p的相對表達水平降低，結(jié)果提示，miR-181a-5p在宮頸癌組織中呈低表達，這與基因芯片檢測結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較，宮頸癌組血清中miR-181a-5p的相對表達水平降低，進一步證實了miR-181a-5p在宮頸癌組織及患者血清中表達下調(diào)。侯歌等[10]研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-181a-5p可增強宮頸癌細胞SiHa放射敏感性，促進癌細胞凋亡。另有研究報道，miR-181a-5p可調(diào)控肝癌細胞增殖，其在肝癌組織中表達明顯下調(diào)[11]。

既往研究顯示，miR-181a可影響卵巢細胞癌的侵襲及遷移行為[12]。本研究顯示，不同分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同F(xiàn)IGO分期的宮頸癌患者癌組織標本及血清標本中miR-181a-5p的相對表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果提示，分化程度越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期越高的宮頸癌組織及患者血清中miR-181a-5p的相對表達水平越低，這說明miR-181a-5p與宮頸癌的惡性程度有關(guān)，其低表達可促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化，因此推測上調(diào)miR-181a-5p的表達可能是宮頸癌臨床治療的潛在靶點。王宏等[13]報道，宮頸癌組織中miR-181a表達下調(diào)，且表達與癌組織分期、分化程度有關(guān)。李瀚等[14]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-181b表達明顯低于正常宮頸組織，miR-181b可抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移能力。劉琴等[15]研究報道，miR-181a在卵巢癌細胞中表達下調(diào)，其表達與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。由以上研究可知，miR-181家族成員中miR-181a-5p、miR-181a、miR-181b與宮頸癌、卵巢癌等腫瘤有關(guān)。

通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-181a-5p診斷宮頸癌的AUC為0.871(95%CI0.745～0.983，P<0.05)，靈敏度為94.42%，特異度為85.39%；血清中miR-181a-5p診斷宮頸癌的AUC為0.752(95%CI0.703～0.914，P<0.05)，靈敏度為89.19%，特異度為79.82%。結(jié)果提示，miR-181a-5p對宮頸癌臨床診斷的特異度和靈敏度均較高。因此，推測miR-181a-5p可作為宮頸癌臨床診斷的評價指標。

綜上所述，miR-181a-5p在患者宮頸癌組織及血清中均呈低表達，且其表達與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可能成為宮頸癌臨床診斷的評價指標。今后本研究將擴大樣本量，進一步探究miR-181a-5p的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，并對相關(guān)機制進行深入研究。