林雪霏，蔣月婷，賴斯華，鄧穎珊，吳愛武△

1.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東廣州 510182；2.中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種醫(yī)院內(nèi)感染病原體，可在人類中引起多種感染，包括心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肺炎(在機(jī)械通氣患者中)、敗血癥和尿路感染[1]。由于鮑曼不動(dòng)桿菌可以在醫(yī)院環(huán)境和設(shè)備上持續(xù)存在并以多藥耐藥病原體的形式出現(xiàn)[2]，因此該菌也成為臨床的研究熱點(diǎn)，但以往臨床研究更多關(guān)注的是其耐藥性和耐藥機(jī)制，對該菌的生理機(jī)制及毒力研究關(guān)注度相對較低。細(xì)菌毒力的物質(zhì)基礎(chǔ)主要包括侵襲力和毒素，其中侵襲力主要包括黏附素、外膜蛋白A、莢膜、侵襲性酶類和生物被膜。目前鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括外膜蛋白A、脂多糖、外膜囊泡、鐵載體、生物被膜等[3]。在細(xì)菌耐藥性日益增強(qiáng)的大背景下，如果細(xì)菌在獲得耐藥性的同時(shí)，其毒力也相應(yīng)增加，將嚴(yán)重影響臨床救治。本研究通過蹭行運(yùn)動(dòng)測定、明膠酶活性試驗(yàn)、生物被膜形成試驗(yàn)、紅細(xì)胞凝集及抑制試驗(yàn)、常見毒力基因的檢測和小鼠體內(nèi)毒力效應(yīng)試驗(yàn)對不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力因子和毒力效應(yīng)進(jìn)行檢測，了解不同耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在獲得耐藥性的同時(shí)其毒力改變情況，為臨床相應(yīng)菌株的抗感染治療和毒力效應(yīng)研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株來源和鑒定 在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室菌種庫收集2016-2018年臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共110株。隨后再用PCR方法檢測鮑曼不動(dòng)桿菌特有的分子標(biāo)記基因blaOXA-51-like，進(jìn)一步確認(rèn)110株菌株均為鮑曼不動(dòng)桿菌。110株鮑曼不動(dòng)桿菌中多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDRAB) 42株，泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(XDRAB)43株，相對敏感鮑曼不動(dòng)桿菌(RDSAB) 25株。各耐藥菌株的定義如下[4]，(1)MDRAB：對下述5類抗菌藥物中3類或者3類以上藥物不敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌，5類抗菌藥物包括氨基糖苷類、碳青酶烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類和含有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑(包括哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西彬/舒巴坦)；(2)XDRAB：僅對1～2種抗菌藥物[主要指替加環(huán)素和(或)多黏菌素]敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌；(3)其余菌株都?xì)w類為RDSAB。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室饋贈(zèng)。

1.2儀器與試劑 LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂、明膠酶、D-甘露糖、結(jié)晶紫、甲醇、無水乙醇、1 mL注射器、細(xì)菌一次性培養(yǎng)皿、96孔聚苯乙烯板、96孔U型聚苯乙烯板均購自廣州捷倍斯生物科技有限公司，有效期內(nèi)使用。6周齡的Balb/c雌性小鼠、鼠糧和墊料購自廣州晴樂生命科學(xué)有限公司；O型、AB型人紅細(xì)胞由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。PCR試驗(yàn)中所有的引物合成和基因測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3方法

1.3.1生長曲線的測定[5]將從-80 ℃冰箱中復(fù)蘇的菌液用新鮮的LB肉湯通過比濁儀調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋晃?0 μL上述菌液用LB肉湯按1∶20稀釋成1 mL；在96孔聚苯乙烯板中加入200 μL稀釋的菌液，每株均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，其中空白對照只加LB肉湯；在搖床上以100 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，保持溫度在37 ℃，每隔2 h取出用酶標(biāo)儀讀取吸光度值(A600)并記錄，監(jiān)測至12 h結(jié)束。

1.3.2蹭行運(yùn)動(dòng)的測定[6]將在-80 ℃冰箱中保存的不同耐藥性的菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上復(fù)蘇后，用無菌槍頭取單個(gè)菌落穿刺LB固體培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿的接觸面；在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，測量其菌暈的長徑。若菌暈長徑>10 mm，則為蹭行運(yùn)動(dòng)陽性。本實(shí)驗(yàn)需獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值。以銅綠假單胞菌ATCC27853作為陽性對照。

1.3.3明膠酶活性檢測[7]將從-80 ℃復(fù)蘇的菌液用新鮮的LB肉湯通過比濁儀調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?0 μL上述菌液接種于含30 g/L的明膠酶固體培養(yǎng)基上，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出后放置4 ℃冰箱4 h后觀察結(jié)果。若菌落周圍出現(xiàn)渾濁環(huán)，則為陽性，以銅綠假單胞菌ATCC27853作為陽性對照。

1.3.4結(jié)晶紫染色測定生物被膜的形成能力[8]將從-80 ℃冰箱中復(fù)蘇的菌液用新鮮的LB肉湯通過比濁儀調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋辉?6孔聚苯乙烯板中加入200 μL稀釋的菌液，每株菌株設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，空白對照只加LB肉湯，在37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)后吸出孔中上清液，用200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗以去除浮游菌；加入200 μL 10%甲醇固定30 min，用200 μL PBS清洗隨后棄去；加入200 μL 1%結(jié)晶紫染液染色20 min，用200 μL PBS清洗隨后棄去；待孔中液體干燥后，每孔加入200 μL 95%乙醇，待孔中與生物被膜結(jié)合的結(jié)晶紫被乙醇完全溶解后，用酶標(biāo)儀讀取各孔A570。3個(gè)復(fù)孔取均值A(chǔ)，未加菌液的空白LB肉湯均值為AC，將均值A(chǔ)與AC比較。細(xì)菌生物被膜形成能力分為4類：A≤AC為陰性；AC4AC為強(qiáng)陽性。

1.3.5微量法進(jìn)行D-甘露糖抵抗紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)[9]將復(fù)蘇的菌液用新鮮的LB肉湯通過比濁儀調(diào)至4麥?zhǔn)蠞岫燃s為1.2×109CFU/mL，再稀釋成濃度為1.0×109CFU/mL的菌液，以4 000 r/min離心15 min，去除上清液；取離心沉淀的菌液用無菌PBS重懸制備新鮮的菌懸液(起始濃度為1×109CFU/mL)及用無菌PBS配制1%新鮮的AB型和O型的紅細(xì)胞懸液(其中加含或不含1%的D-甘露糖，各1份)；在96孔U型聚苯乙烯板中加入制備好的菌懸液50 μL進(jìn)行倍比稀釋；每個(gè)系列的孔中加入各50 μL含或不含1%甘露糖的AB型或O型的1%紅細(xì)胞懸液，于振蕩器上振蕩混勻；放入4 ℃冰箱靜置孵育2 h，觀察孔中是否有紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。若紅細(xì)胞在孔底聚集成小圓點(diǎn)，則為陰性；若紅細(xì)胞遍布整個(gè)孔底，則為陽性。以50 μL PBS中加入50 μL紅細(xì)胞懸液作為陰性對照，以大腸埃希菌ATCC25922作為陽性對照。

1.3.6毒力基因的檢測 用煮沸法提取細(xì)菌DNA。選取毒力基因BasD、BauA、Omp33-36、traT。25 μL反應(yīng)體系：預(yù)混液12.5 μL，模板2 μL，10 μmoL/L的上下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。引物序列合成及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[10]，引物序列見表1。每種基因陽性條帶挑取1株菌株，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果提交到GenBank在線數(shù)據(jù)庫應(yīng)用比對工具進(jìn)行比對。

表1 毒力基因PCR擴(kuò)增引物

1.3.7小鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)[6]隨機(jī)選取不同耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌各一株進(jìn)行復(fù)蘇，將復(fù)蘇的菌液用新鮮的LB肉湯通過比濁儀調(diào)至4麥?zhǔn)蠞岫燃s為1.2×109CFU/mL，再稀釋成濃度為1.0×109CFU/mL的菌液；稀釋后的菌液以1.0×109CFU/mL作為初始濃度進(jìn)行10倍遞增的稀釋至菌液濃度為1.0×104CFU/mL，其中包括1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104CFU/mL 6個(gè)濃度；將57只小鼠隨機(jī)分成19組，每組3只，其中1～18組為感染組，19組為對照組；感染組每只小鼠注射200 μL菌液，對照組注射等量的生理鹽水；1～6組分別接種菌液濃度為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104CFU/mL的RDSAB，7～12組接種上述濃度的MDRAB，13～18組接種上述濃度的XDRAB。接種后每天觀察小鼠的死亡情況，連續(xù)觀察10 d。

2 結(jié) 果

2.1生長曲線的測定 隨機(jī)選取不同耐藥性的菌株各10株檢測其生長能力。在培養(yǎng)的12 h里，隨著時(shí)間的增加其測定的A值也增加。RDSAB比MDRAB或者XDRAB生長得快，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌生長曲線

2.2蹭行運(yùn)動(dòng)的測定 在110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，除了2株RDSAB蹭行運(yùn)動(dòng)陽性外，其余菌株均為陰性。MDRAB和XDRAB均未觀察到蹭行運(yùn)動(dòng)，蹭行運(yùn)動(dòng)能力在組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3明膠酶活性的檢測 在110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，全部菌株明膠酶活性均為陰性，不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生以明膠酶為代表的侵襲性酶類的能力無差異。

2.4不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力測定 110株試驗(yàn)株均能形成生物被膜。RDSAB的生物被膜形成能力比MDRAB或XDRAB的生物被膜形成能力強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。25株RDSAB生物被膜形成能力以強(qiáng)陽性(56.00%，14/25)為主，其次為陽性(36.00%，9/25)。而42株MDRAB和43株XDRAB表現(xiàn)為以陽性為主，分別占59.52%(25/42)和69.77%(30/43)；其次為弱陽性，分別占35.71%(15/42)和18.60%(8/43)。見表2。

表2 不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力的比較[n(%)]

2.5紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果 在110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，只有1株RDSAB在有或者無D-甘露糖存在的條件下，均能與AB型和O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，但組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6毒力基因的檢測 常見毒力基因BasD、BauA、Omp33-36和traT中，除了基因traT無陽性擴(kuò)增外，其他基因均可檢出，部分陽性擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

注：M為DNA marker 2000；1為BasD基因(868 bp)；2為BauA基因(224 bp)；3為Omp33-36基因(726 bp)；N為陰性對照。

在110株鮑曼不動(dòng)桿菌中，毒力基因BasD具有較高的檢出率，為59.1%(65/110)；毒力基因BauA和Omp33-36檢出率較低，分別為6.4%(7/110)和3.6%(4/110)；毒力基因traT無檢出。見表3。

表3 不同耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌常見毒力基因的檢出結(jié)果[n(%)]

對比不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌毒力基因的檢出情況，MDRAB的BasD毒力基因檢出率比RDSAB高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而RDSAB的毒力基因Omp33-36檢出率比MDRAB和XDRAB高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MDRAB的BauA和BasD毒力基因檢出率比XDRAB高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、5、6。

表4 RDSAB和MDRAB檢出的毒力基因結(jié)果比較(n)

表5 RDSAB和XDRAB檢出的毒力基因結(jié)果比較(n)

2.7小鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn) 對3種不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行小鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過10 d的觀察，實(shí)驗(yàn)組和對照組無1例小鼠發(fā)生死亡。

表6 MDRAB和XDRAB的毒力基因的比較(n)

3 討 論

近些年來對于鮑曼不動(dòng)桿菌的研究主要集中在流行特征和耐藥機(jī)制方面，而對鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力機(jī)制研究比較少。目前鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括外膜蛋白A、脂多糖、磷脂酶D、外膜囊泡、生物被膜、鐵載體、運(yùn)動(dòng)能力等[3]。

鮑曼不動(dòng)桿菌是機(jī)會(huì)致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中并長期存活，可通過醫(yī)療器械或者醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行克隆性傳播[2]，體外存活能力是病原菌重要的致病條件。本研究中對不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行生長能力的測定，結(jié)果表明在體外不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌生長能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明耐藥性的獲得并未導(dǎo)致菌株體外生存能力減弱。

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性與其引起疾病的能力密切相關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌無鞭毛不能主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，但其具備Ⅳ型菌毛可以介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生不依賴鞭毛的獨(dú)特運(yùn)動(dòng)，此運(yùn)動(dòng)叫做蹭行運(yùn)動(dòng)[11]。在許多革蘭陰性菌中，Ⅳ型菌毛通過介導(dǎo)蹭行運(yùn)動(dòng)，參與細(xì)菌在宿主體內(nèi)黏附和定植并引起免疫應(yīng)答，同時(shí)還在生物被膜形成早期發(fā)揮作用[12]。本研究中，MDRAB和XDRAB均未檢測到蹭行運(yùn)動(dòng)，而RDSAB雖然有2株菌株蹭行運(yùn)動(dòng)陽性，但與MDRAB、XDRAB比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明不同耐藥表型鮑曼不動(dòng)桿菌在蹭行運(yùn)動(dòng)能力方面無明顯差異，提示感染時(shí)這些菌株的黏附能力可能也無差異。

明膠酶是細(xì)菌產(chǎn)生的一種侵襲性酶類，是具有水解明膠、血紅蛋白、膠原蛋白及其他生物活性肽功能的金屬蛋白酶，可增強(qiáng)細(xì)菌感染性炎癥發(fā)生時(shí)的致病力[7]。本研究中，110株菌株均未檢測出明膠酶活性，說明不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生以明膠酶為代表的侵襲性酶類的能力無明顯差異。

鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜的形成與其耐藥性和致病力之間的相關(guān)性報(bào)道較多，但研究結(jié)果差異較大。BARDBARI等[13]研究顯示MDRAB生物被膜形成能力比非MDRAB生物被膜形成能力強(qiáng)。而QI等[14]研究認(rèn)為隨著生物膜形成能力的增強(qiáng)其耐藥性相應(yīng)降低。本研究結(jié)果顯示，RDSAB的生物被膜形成能力比MDRAB或XDRAB的生物被膜形成能力強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RDSAB生物被膜形成能力以強(qiáng)陽性(56.00%)為主，其次為陽性(36.00%)；而MDRAB和XDRAB以陽性為主，分別占59.52%和69.77%，其次為弱陽性，分別占35.71%和18.60%。耐藥菌株生物被膜形成能力較相對敏感菌株弱，表明菌株耐藥性的獲得使其生物被膜的形成能力相應(yīng)減弱，導(dǎo)致其在致病能力方面可能也會(huì)相應(yīng)減弱，這可能是菌株為了在人體更好地生存下來而表現(xiàn)出的一種對人體的適應(yīng)性改變，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

細(xì)菌的菌毛除了可以使細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞，對紅細(xì)胞也有凝集能力。細(xì)菌的致病力與細(xì)菌的黏附能力、血凝能力相關(guān)，血凝能力強(qiáng)的細(xì)菌毒力也強(qiáng)。在本研究菌株的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)中，僅1株RDSAB在有或者無D-甘露糖存在的條件下，均能與AB型和O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，具有紅細(xì)胞凝集能力，其余菌株紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)均為陰性。試驗(yàn)結(jié)果提示鮑曼不動(dòng)桿菌整體凝集紅細(xì)胞的能力弱，不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌對紅細(xì)胞的凝集能力無明顯差異。

鮑曼不動(dòng)桿菌常見的毒力基因有介導(dǎo)與宿主細(xì)胞結(jié)合的黏附和侵襲相關(guān)毒力基因Omp33-36，鐵載體的合成和運(yùn)輸相關(guān)毒力的基因(BasD和BauA)及編碼R6-5質(zhì)粒特異的外膜蛋白的毒力基因traT[10]。本研究結(jié)果顯示，在鮑曼不動(dòng)桿菌中，除了毒力基因BasD具有較高的檢出率(59.1%)外，毒力基因BauA和Omp33-36檢出率較低，未檢測到毒力基因traT，總體上，研究結(jié)果顯示鮑曼不動(dòng)桿菌毒力基因檢出率不高，說明鮑曼不動(dòng)桿菌是一種相對低毒力的細(xì)菌，與該菌在臨床上主要引起免疫功能低下或感染的現(xiàn)狀相吻合。對比不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌毒力基因的檢出情況，MDRAB的BasD毒力基因檢出率比RDSAB高，MDRAB的BauA和BasD毒力基因檢出率比XDRAB高，而RDSAB的毒力基因Omp33-36檢出率比MDRAB和XDRAB高。這些結(jié)果提示，在不同耐藥表型鮑曼不動(dòng)桿菌中均可檢出各占優(yōu)勢的毒力基因，說明這些不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌毒力特征可能類似，差異不明顯。

小鼠體內(nèi)細(xì)菌感染毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將不同濃度不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株在小鼠體內(nèi)進(jìn)行注射感染，感染10 d后所有小鼠均未出現(xiàn)死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌均為低毒力的菌株，對動(dòng)物致病能力不強(qiáng)。

綜上所述，不同耐藥表型的鮑曼不動(dòng)桿菌除了在生物被膜形成能力方面敏感菌株比耐藥菌株強(qiáng)以外，在其他的細(xì)菌毒力檢測試驗(yàn)中，不同耐藥表型鮑曼不動(dòng)桿菌之間無明顯差異，也就是說菌株在獲得耐藥性的同時(shí)其毒力并沒有相應(yīng)增加。鮑曼不動(dòng)桿菌作為重要的院內(nèi)感染菌，其致病性、耐藥性逐漸增強(qiáng)的同時(shí)伴隨的是治療難度的增加，因此，臨床和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意監(jiān)測其毒力變化趨勢，為臨床治療提供依據(jù)。