吳李萍，羅 敏，盧 旭，卿克勤，李紅霞

四川省成都市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610041

新生兒溶血癥(HDN)指因母嬰血型不合、珠蛋白生成障礙性貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏等各種病因引起胎兒或新生兒紅細(xì)胞破壞增多，臨床通常特指母嬰血型不合引起的HDN[1-3]。母嬰血型不合HDN主要見于ABO血型系統(tǒng)不合[1]，Rh血型系統(tǒng)次之，其他血型系統(tǒng)如MN、Kidd等不合引起的溶血多為個案報(bào)道[2-4]。ABO血型不合導(dǎo)致的HDN發(fā)生概率較高，但嚴(yán)重病例占比相對較低[5]。隨著二孩政策全面放開，約43.70%的育齡婦女有意愿生育二孩[6]，但其將經(jīng)歷多次妊娠和分娩，ABO血型不合引起的HDN發(fā)生率及其嚴(yán)重程度的變化有待大量臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。本次研究擬通過回顧2016—2019年本院抗體效價及HDN篩查結(jié)果，探討ABO系統(tǒng)HDN發(fā)生的相關(guān)影響因素及其變化，為HDN早期預(yù)防、診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 所有資料均來源于2016—2019年于成都市第一人民醫(yī)院門診和住院就診的患者。統(tǒng)計(jì)分析共納入3 855例O型血孕婦(丈夫非O型血)產(chǎn)前抗體效價結(jié)果，628例ABO系統(tǒng)HDN試驗(yàn)結(jié)果，以及236例母嬰臨床資料齊全的抗體效價和HDN試驗(yàn)結(jié)果。母嬰臨床資料包括母親年齡、抗體效價、孕次、胎次和患兒性別、日齡、ABO血型、胎齡，通過上述資料分析HDN發(fā)生的相關(guān)影響因素。其中一胎患兒169例，二胎患兒67例；足月患兒212例，早產(chǎn)患兒24例；孕婦孕1次125例，孕2次54例，孕3次及以上57例，孕次達(dá)9次者1例。

1.2儀器與試劑 ABO和RhD血型鑒定卡、抗人球蛋白卡、37 ℃孵育器及專用離心機(jī)、戴安娜全自動配血系統(tǒng)均購自北京市斑珀斯技貿(mào)有限公司；ABO反定型細(xì)胞、不規(guī)則抗體篩查細(xì)胞均購自長春博德生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；56 ℃數(shù)顯電熱恒溫震蕩水浴箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司；2-巰基乙醇購自上海血液生物醫(yī)藥責(zé)任公司。全部血型和抗體效價檢測標(biāo)本為乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血2.0 mL。

1.3方法

1.3.1血型檢測及不規(guī)則抗體篩查 采用戴安娜全自動配血系統(tǒng)檢測孕婦血型，對Rh陰性孕婦增加不規(guī)則抗體篩查。用奧森多血型卡檢測新生兒血型。

1.3.2抗體效價 在孕婦懷孕中期采集夫妻靜脈血各2.0 mL，離心后取150 μL的2-巰基乙醇與150 μL孕婦血漿混勻，37 ℃孵育30 min后，采用抗人球蛋白法于戴安娜全自動配血系統(tǒng)檢測抗體效價。

1.3.3游離抗體試驗(yàn) 于抗人球蛋白卡中分別加入2%標(biāo)準(zhǔn)A、B、O紅細(xì)胞40 μL，再加入患兒血漿100 μL，37 ℃孵育15 min，離心觀察結(jié)果。

1.3.4紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn) 取不少于600 μL患兒紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌6次，取300 μL紅細(xì)胞與300 μL生理鹽水混勻，于56 ℃水浴箱中震蕩放散10 min，取出后立即離心，留上層放散液，于抗人球蛋白卡中分別加入2%標(biāo)準(zhǔn)A、B、O紅細(xì)胞40 μL，再加入放散液100 μL，于37 ℃孵育15 min，離心觀察結(jié)果，參照全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)[7]。

1.3.5直接抗人球蛋白試驗(yàn) 取1.3.4所述40 μL患兒洗滌6次的紅細(xì)胞，加入1 mL生理鹽水混勻，取40 μL細(xì)胞懸液加入抗人球蛋白卡，離心觀察結(jié)果。

1.4結(jié)果判讀

1.4.1抗體效價 根據(jù)戴安娜全自動配血系統(tǒng)成像結(jié)果“2+”標(biāo)準(zhǔn)判讀抗體效價結(jié)果，以滴度表示，分別記為<1∶32、1∶32、1∶64、1∶128和≥1∶256。

1.4.2HDN 3項(xiàng)檢查中有2項(xiàng)陽性或者紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)單項(xiàng)陽性均為HDN[8]。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡和不同血型組合夫妻抗體效價分布情況 2016—2019年送檢抗體效價檢測的O型孕婦共3 855例，年齡18～42歲，平均(26.95±2.81)歲。不同年齡段孕婦抗體效價差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.142，P>0.05)，抗體效價IgG抗A(B)≥1∶64者1 819例，占47.19%。不同血型組合夫妻抗體效價差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=270.461，P<0.05)，其中O-AB組合抗AB效價≥1∶64 517例，占60.35%，O-A組合孕婦抗A效價≥1∶64 1 908例,占54.04%，O-B組合抗B效價≥1∶64 1 430例，占33.29%。見表1。

表1 不同年齡和不同血型組合夫妻抗體效價分布情況[n(%)]

2.2HDN陽性檢出率與新生兒日齡關(guān)系 送檢628例ABO系統(tǒng)HDN試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDN陽性332例，檢出率為52.87%。其中男性患兒317例，HDN陽性153例，HDN陽性檢出率為48.26%；女性患兒311例，HDN陽性179例，HDN陽性檢出率為57.56%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.439，P<0.05)；A型患兒326例，HDN陽性197例，HDN陽性檢出率60.43%，B型患兒302例，HDN陽性135例，HDN陽性檢出率44.70%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.562，P<0.05)。

新生兒日齡呈偏態(tài)分布，中位日齡2日?；純篐DN陽性檢出率隨日齡增加逐漸降低，患兒出生后24 h內(nèi)HDN陽性檢出率最高。不同日齡患兒HDN陽性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=67.696，P<0.05)。3項(xiàng)溶血試驗(yàn)中，紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)最敏感，游離抗體試驗(yàn)次之，直接抗人球蛋白試驗(yàn)最低，3項(xiàng)檢測的陽性率均隨患兒日齡增加而有降低趨勢，見表2。

表2 HDN陽性檢出率與新生兒日齡關(guān)系[n(%)]

2.3HDN相關(guān)影響因素的Logistic回歸分析 Logistic回歸分析顯示，與HDN發(fā)生相關(guān)的影響因素為孕婦IgG抗體效價和胎次。進(jìn)一步分析顯示，HDN陽性檢出率隨IgG抗體效價升高而逐漸升高，IgG抗體效價<1∶32時，HDN陽性檢出率為14.29%；IgG抗體效價≥1∶256時，HDN陽性檢出率高達(dá)78.33%，不同效價組間HDN檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=51.094，P<0.05)。236例患兒HDN陽性檢出率為55.93%，二胎患兒HDN陽性檢出率為70.15%，明顯高于一胎患兒的50.30%(χ2=7.672，P<0.05)。盡管Logistic回歸分析顯示孕次不是HDN發(fā)生的影響因素，但其母親抗體高效價比例和HDN陽性率隨孕次增加而升高，其中孕5次及以上孕婦共12例，所生新生兒均發(fā)生HDN。見表3。

表3 母嬰不同影響因素HDN陽性率比較

續(xù)表3 母嬰不同影響因素HDN陽性率比較

3 討 論

HDN的發(fā)病機(jī)制為胎兒從父親處遺傳到了母親不具有的血型抗原，母親由于妊娠、分娩或輸血產(chǎn)生了針對該血型抗原的IgG抗體，IgG抗體可以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒血液循環(huán)與胎兒紅細(xì)胞抗原結(jié)合，導(dǎo)致胎兒紅細(xì)胞致敏甚至溶血[9]，溶血程度與IgG抗體效價有很大關(guān)系[10]。胎兒及HDN導(dǎo)致的高膽紅素血癥容易引發(fā)核黃疸，治療不及時將會產(chǎn)生后遺癥。早期篩查和診斷HDN具有重要臨床意義。孕婦抗體效價檢測是產(chǎn)前預(yù)測HDN發(fā)生及嚴(yán)重程度的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，HDN試驗(yàn)為HDN的確診依據(jù)，兩者抗體效價檢測最常用的方法為試管法和微柱凝膠法。微柱凝膠法自1990年首次被報(bào)道以來[11]，因其操作簡便、結(jié)果判讀客觀且可拍照保存，可上機(jī)進(jìn)行大批量檢測等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[12]。

本研究中孕婦IgG抗A(B)效價≥1∶64者占47.19%，與葉海輝等[13]報(bào)道的49.5%接近，明顯高于安瑩花等[14]報(bào)道的28.97%，主要由于本研究與葉海輝等的結(jié)果來自微柱凝膠法，而安瑩花等的結(jié)果來自試管法。采用微柱凝膠法并通過全自動血型分析儀加樣和檢測具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，凝膠卡片拍照判讀結(jié)果較試管法肉眼判讀結(jié)果更客觀。本研究回顧孕婦≥1∶64抗A效價者占54.04%，明顯高于抗B效價≥1∶64的33.29%；患兒A型HDN陽性檢出率為60.43%，明顯高于B型患兒的44.70%，與既往報(bào)道的不同血型夫妻組合孕婦抗體效價無差異的結(jié)論不一致[9,15]。不同血型間差異是否由于人群中A型和O型血人群比例較高及胎兒紅細(xì)胞上的A型抗原決定簇較B型多引起，還是由于樣本量較小或者臨床送檢偏倚導(dǎo)致，仍需要后續(xù)收集更加大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

HDN試驗(yàn)陽性檢出率為52.87%，患兒日齡呈偏態(tài)分布，以出生后24 h內(nèi)最高，且隨日齡增加有降低趨勢，與研究報(bào)道一致[15]。主要由于胎兒離開母體從缺氧環(huán)境進(jìn)入有氧環(huán)境，新生兒體內(nèi)生理性紅細(xì)胞溶解立即啟動，加上從母體獲得的同種血型抗體的病理性破壞，致敏紅細(xì)胞隨著時間推移逐漸破壞減少，血漿中的游離抗體也隨之消耗減少，因此早期篩查有助于提高HDN檢測的陽性率。在實(shí)際工作中，由于新生兒血容量較少，各項(xiàng)檢驗(yàn)采血過多即可能造成患兒貧血[16]，加之新生兒血管較細(xì)，采血較困難，容易出現(xiàn)標(biāo)本凝集，難免造成重復(fù)采血。因此，對于高風(fēng)險孕婦所生新生兒可在出生時常規(guī)采集臍帶血進(jìn)行HDN篩查[17]，不僅可提高溶血3項(xiàng)檢測陽性率，可早期診治HDN，還可以減少患兒因采血過多繼發(fā)貧血，提高患兒生活質(zhì)量。

Logistic回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDN發(fā)生相關(guān)的影響因素為孕婦IgG抗體效價和胎次。進(jìn)一步分析顯示HDN陽性檢出率隨孕婦效價升高而升高，抗體效價為1∶128孕婦所生新生兒HDN陽性率高達(dá)73.68%，明顯高于抗體效價為1∶64的孕婦(57.58%)，提示孕婦體內(nèi)IgG抗體效價越高其致敏紅細(xì)胞的能力越強(qiáng)，其HDN發(fā)生的可能性越高。二胎患兒HDN陽性率為70.15%，明顯高于一胎患兒的50.30%，提示完整的妊娠分娩較早期流產(chǎn)或主動終止妊娠對刺激母體抗體產(chǎn)生及HDN有更大影響。既往研究表明，孕婦體內(nèi)的IgG抗體效價和數(shù)量隨著孕期增加而增加[18]，說明妊娠后期抗體效價更值得關(guān)注。針對孕中期檢測抗體效價≥1∶128的孕婦，尤其是有反復(fù)流產(chǎn)、引產(chǎn)史及多次分娩史的孕婦，應(yīng)在孕后期定期復(fù)查抗體效價，并監(jiān)測胎兒健康狀況，對于病情嚴(yán)重者應(yīng)采取服用或注射藥物等措施[19]，符合條件者進(jìn)行血漿置換或?qū)m內(nèi)輸血[20]。

綜上，二孩政策下，臨床應(yīng)加強(qiáng)高風(fēng)險孕婦的識別與管理，對有妊娠流產(chǎn)史、分娩史及上一胎發(fā)生HDN等相關(guān)影響因素的O型抗體效價≥1∶128的孕婦應(yīng)定期監(jiān)測抗體效價并評估胎兒宮內(nèi)健康狀況；對高危孕婦分娩新生兒，盡早進(jìn)行HDN篩查，以早期診斷HDN并及時治療。