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        三七不同來源指紋圖譜數(shù)字化研究

        2021-07-29 04:59:24童湘?zhèn)?/span>石坤連梁業(yè)婷易延逵
        醫(yī)學(xué)信息 2021年14期
        關(guān)鍵詞:參照物皂苷指紋

        童湘?zhèn)ィみB,梁業(yè)婷,沈 穎,周 蓓,易延逵

        (1.漣源市人民醫(yī)院藥劑科,湖南 漣源 417100;2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,廣東 廣州 510515;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,廣西 南寧 530001)

        三七為五加科多年生草本植物三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根莖,具有散瘀止血,消腫定痛的功效,用于各種原因?qū)е碌某鲅?,淤血和跌打損傷[1]。三七的主要活性成分是三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)[2],研究主要以該類成分為參照物建立指紋圖譜。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載[3,4],已有學(xué)者對(duì)三七總皂苷的提取、分離純化的方法和技術(shù)進(jìn)行了研究。這些成果為其指紋圖譜和藥理的研究奠定了基礎(chǔ)。中藥指紋圖譜[5]是指將中藥適當(dāng)處理后,應(yīng)用特定分析手段獲取能夠表示其特性的圖譜,截止2020 年5 月,大批學(xué)者對(duì)三七指紋圖譜的建立做了研究,包括對(duì)三七HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了較多研究[6-8]、采用HPLC 指紋圖譜來鑒別人參、西洋參及三七[9]、利用高效液相聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)建立三七藥材的指紋圖譜[10]以及借助主要成分分析和聚類分析方法比較不同批次、產(chǎn)地的三七藥材質(zhì)量的差異性,為全面評(píng)估三七藥材質(zhì)量提供參考[11]。本文在前期對(duì)指紋圖譜研究基礎(chǔ)上,針對(duì)天然產(chǎn)物成分的復(fù)雜性,提出了包括“全指紋圖譜系”“區(qū)間指紋圖譜”的構(gòu)建等,同時(shí)考慮針對(duì)目前指紋圖譜研究存在的問題,提出了進(jìn)行中藥指紋圖譜峰值的數(shù)字化問題研究[12]。本次主要對(duì)三七指紋圖譜和考察不同來源三七指紋圖譜的波動(dòng)范圍進(jìn)行探索。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器設(shè)備 島津高效液相色譜儀(島津<蘇州>有限公司),SK1200H 型超聲器(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司),DFY-300 搖擺式多功能高速中藥粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司),MSX(SD EE)型電子天平(Sartorius,Goetiingen,Germanny),BL-600 型電子天平(廈門佰倫斯電子科技有限公司)。

        1.2 材料及藥品 對(duì)照品:三七皂苷R1(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110745-200415,供含量測(cè)定用)、人參皂苷Re(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110754-200320,供含量測(cè)定用)、人參皂苷Rg1(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)22427-39-0,供含量測(cè)定用)。藥材:三七(批號(hào):S9219506,購自廣東省藥材公司中藥飲片廠)、三七(批號(hào):S9218412,購自廣東省藥材公司中藥飲片廠)、三七(批號(hào):190705,購自廣東省采芝林醫(yī)藥公司)、三七(批號(hào):180907,購自廣東省采芝林醫(yī)藥公司)、三七(批號(hào):180608,購自四川薪菊花中藥飲片股份有限公司),上述三七藥材經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院的劉傳明教授鑒定均為五加科三七的干燥根和根莖。試劑:D-101 型大孔吸附樹脂(批號(hào):HC191026,和誠新材料有限公司);甲醇、乙腈為色譜純,水為重蒸水,其它試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 色譜柱[9,13,14]:InertSustainTM AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫見表1,流速:1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm,柱溫:25 ℃,進(jìn)樣量10 μl,記錄時(shí)間為70 min。

        表1 梯度洗脫程序

        2.2 供試品溶液的制備 精密稱取三七藥材粉末(過60 目篩)2.0 g,置于錐形瓶中,加入70%乙醇50 ml,浸泡30 min,80 ℃恒溫水浴加熱冷凝回流提取1.5 h,過濾,濾液濃縮至2 ml 左右,與適量大孔樹脂(95%乙醇浸泡至無氣泡)混合、拌勻,揮干。D-101 型大孔樹脂柱色譜分離純化,用95%乙醇大孔樹脂浸泡3~4 h 至無氣泡,在色譜柱底部墊一小團(tuán)棉花,裝大孔樹脂層10 cm 左右,純凈水洗至無醇味,壓平大孔樹脂柱層面,加入樣品,放一團(tuán)棉花。洗脫,先用200 ml純凈水洗脫,水洗脫液棄去,再用60 ml 80%乙醇洗脫[3],洗脫流速為60 滴/min,乙醇洗脫液濃縮至干,用70%甲醇溶解,用5 ml 容量瓶定容,混合均勻,通過0.45 μm 的微孔濾膜,即得。

        2.3 參照物的選擇和制備 對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1等三種對(duì)照品,用70%的甲醇配制成每5 ml 均含0.4 mg 的一份混合對(duì)照品溶液和三份單一對(duì)照品溶液。

        2.4 測(cè)定法 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10 μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,記錄70 min 的色譜圖,即得。以分離度好的、峰形適宜的三七皂苷R1的圖譜峰即8 號(hào)峰為參照物峰,記為S 峰,見圖1。

        圖1 參照物色譜圖與三七藥材共有指紋峰指紋圖

        2.5 三七指紋圖譜的建立 取10 批次同一來源藥材粉末各1 份,按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品,“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定指紋圖譜,采用“中藥色譜指紋圖譜圖相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A 版)”進(jìn)行處理,以全譜和峰面積進(jìn)行匹配,以第六批即S6 色譜圖為參照,完成自動(dòng)匹配數(shù)據(jù),生成對(duì)照?qǐng)D譜R,并以其為參照,完成相似度評(píng)價(jià),10 批樣品的相似度均在0.80 以上,見圖2。共有指紋峰的標(biāo)定:采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰,以圖譜中三七皂苷R1為參照物,將各色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間比較,其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間,計(jì)算10 批次指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。其中10 個(gè)色譜峰為各樣品所共有,故標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰。各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為峰-1(0.1722~0.1769)、峰-2(0.2498~0.2535)、峰-3(0.2995~0.3041)、峰-4(0.4055~0.4109)、峰-5(0.4551~0.4604)、峰-6(0.5103~0.5141)、峰-7(0.8324~0.8346)、峰-S(1.0000)、峰-9(1.4172~1.4193)、峰-10(1.5492~1.5546)。同時(shí)以各將各色譜峰峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積比較,其比值為各色譜峰的相對(duì)峰面積,計(jì)算10 批次指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)峰面積。共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為峰-1(0.1837~0.2777)、峰-2(0.0152~0.1104)、峰-3(0.3015~0.5118)、峰-4(0.1128~0.2807)、峰-5(0.0721~0.1343)、峰-6(0.0428~0.0499)、峰-7(0.0288~0.0638)、峰-S(1.0000)、峰-9(5.6985~5.8728)、峰-10(0.7872~0.8160)。

        圖2 相似度計(jì)算(全譜)圖

        2.6 方法學(xué)考查

        2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6 次,計(jì)算各次指紋峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間,結(jié)果RSD<3%,表明色譜儀器精密度良好,符合指紋圖譜測(cè)定要求。

        2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三七藥材粉末6 份,按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣,計(jì)算各次指紋峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間,結(jié)果RSD<2.5%,表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

        2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品,按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定,分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣,計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的指紋峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間,結(jié)果RSD<2.2%,表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        3 不同來源三七藥材指紋圖譜波動(dòng)范圍的考察

        3.1 不同來源三七藥材指紋圖譜制定 取5 批不同來源的藥材粉末各1 份,按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品,制定指紋圖譜。以圖譜中三七皂苷R1 為參照物峰,將各色譜峰保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間和峰面積比較,其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間,相對(duì)峰面積,圖譜見圖3。

        圖3 5 批不同來源的三七指紋圖譜的比較圖

        3.2 不同來源三七藥材指紋圖譜波動(dòng)范圍 對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積歸納分析其波動(dòng)范圍。以各不同來源三七指紋譜各色譜峰保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間和峰面積比較,其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為峰-1(0.1736~0.1784)、峰-2(0.2425~0.2548)、峰-3(0.2992~0.3056)、峰-4(0.4058~0.4134)、峰-5(0.4527~0.4597)、峰-6(0.5103~0.5151)、峰-7(0.8324~0.8344)、峰-S(1.0000)、峰-9(1.4167~1.4198)、峰-10(1.5497~1.5546)。各共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為峰-1(0.1567~0.2272)、峰-2(0.0922~0.2097)、峰-3(0.2402~0.4975)、峰-4(0.1569~0.1997)、峰-5(0.1082~0.1405)、峰-6(0.0487~0.0795)、峰-7(0.0494~0.0847)、峰-S(1.0000)、峰-9(4.0436~5.8524)、峰-10(0.4935~0.8973)。

        4 討論

        在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的通知中,對(duì)于中藥注射劑原料來源上要求動(dòng)、植物藥材均應(yīng)固定品種、藥用部位、產(chǎn)地、采收期、產(chǎn)地加工和炮制方法,礦物藥應(yīng)固定產(chǎn)地和炮制、加工方法[13]。這就要求制定產(chǎn)品藥材的指紋圖譜要求來源加工工藝等要固定,對(duì)于不同來源加工工藝藥材而言,要分別制定指紋圖譜。本試驗(yàn)主要考察不同來源藥材的波動(dòng)范圍,為其質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。本試驗(yàn)通過10 批次同一來源三七藥材指紋圖譜研究分析,制定了其指紋圖譜;本試驗(yàn)通過5 批來源不同的三七考察指紋峰的波動(dòng)范圍;通過初步考察三七藥材指紋峰波動(dòng)范圍,可以初步確定三七藥材指紋圖譜指紋峰波動(dòng)范圍如下:相對(duì)保留時(shí)間分別為峰-1(0.1730~0.1790)、峰-2(0.2400~0.2550)、峰-3(0.2990~0.3060)、峰-4(0.4050~0.4140)、峰-5(0.4520~0.4600)、峰-6(0.5100~0.5160)、峰-7(0.8320~0.8350)、峰-S(1.0000)、峰-9(1.4160~1.4200)、峰-10(1.5490~1.5550)。各共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為峰-1(0.1560~0.2280)、峰-2(0.0920~0.2100)、峰-3(0.2400~0.4980)、峰-4(0.1560~0.2000)、峰-5(0.1080~0.1410)、峰-6(0.0480~0.0800)、峰-7(0.0490~0.0850)、峰-S(1.0000)、峰-9(4.0430~5.8530)、峰-10(0.4930~0.8980)。

        本結(jié)果共有峰的相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)范圍較小,而相對(duì)峰面積波動(dòng)范圍較大。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)范圍主要跟儀器方法等有關(guān),因而其波動(dòng)范圍不會(huì)很大;相對(duì)峰面積波動(dòng)范圍跟成分的含量相關(guān),不同來源的藥材含量差異越大,波動(dòng)范圍就越大。因此,建立三七藥材HPLC 指紋圖譜的數(shù)字化波動(dòng)范圍對(duì)如何有效把控三七藥材質(zhì)量有一定的參考意義。本試驗(yàn)為藥材的質(zhì)量控制研究提供了可參考試驗(yàn)依據(jù)。但本試驗(yàn)試驗(yàn)樣本數(shù)較少,試驗(yàn)使用的三七均產(chǎn)自云南,因而可進(jìn)一步增加試驗(yàn)樣本數(shù),收集試驗(yàn)使用的三七藥材產(chǎn)地盡量覆蓋到三七主要產(chǎn)地。

        以往建立三七指紋圖譜的研究中,很少對(duì)三七提取液經(jīng)過分離純化后再建立指紋圖譜。本試驗(yàn)參考了三七有效成分分離純化的方法,選用D-101 型大孔樹脂對(duì)三七藥材提取液進(jìn)行分離純化[15]。將純化前后的供試品得到的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行比較,結(jié)果表明,純化后建立的指紋圖譜,5 min 前的峰高、峰面積會(huì)明顯下降,5 min 后的峰的峰高和峰面積降低不明顯,說明純化有利于減少雜質(zhì)的含量。

        綜上,本次初步探究獲得的三七藥材指紋圖譜波動(dòng)范圍可對(duì)三七藥材的質(zhì)量控制研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

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