童湘?zhèn)ィみB，梁業(yè)婷，沈 穎，周 蓓，易延逵

（1.漣源市人民醫(yī)院藥劑科，湖南 漣源 417100；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001）

三七為五加科多年生草本植物三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]的干燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，用于各種原因?qū)е碌某鲅?，淤血和跌打損傷[1]。三七的主要活性成分是三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）[2]，研究主要以該類成分為參照物建立指紋圖譜。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載[3，4]，已有學(xué)者對(duì)三七總皂苷的提取、分離純化的方法和技術(shù)進(jìn)行了研究。這些成果為其指紋圖譜和藥理的研究奠定了基礎(chǔ)。中藥指紋圖譜[5]是指將中藥適當(dāng)處理后，應(yīng)用特定分析手段獲取能夠表示其特性的圖譜，截止2020 年5 月，大批學(xué)者對(duì)三七指紋圖譜的建立做了研究，包括對(duì)三七HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了較多研究[6-8]、采用HPLC 指紋圖譜來鑒別人參、西洋參及三七[9]、利用高效液相聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)建立三七藥材的指紋圖譜[10]以及借助主要成分分析和聚類分析方法比較不同批次、產(chǎn)地的三七藥材質(zhì)量的差異性，為全面評(píng)估三七藥材質(zhì)量提供參考[11]。本文在前期對(duì)指紋圖譜研究基礎(chǔ)上，針對(duì)天然產(chǎn)物成分的復(fù)雜性，提出了包括“全指紋圖譜系”“區(qū)間指紋圖譜”的構(gòu)建等，同時(shí)考慮針對(duì)目前指紋圖譜研究存在的問題，提出了進(jìn)行中藥指紋圖譜峰值的數(shù)字化問題研究[12]。本次主要對(duì)三七指紋圖譜和考察不同來源三七指紋圖譜的波動(dòng)范圍進(jìn)行探索。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備 島津高效液相色譜儀（島津<蘇州>有限公司），SK1200H 型超聲器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），DFY-300 搖擺式多功能高速中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司），MSX（SD EE）型電子天平（Sartorius，Goetiingen，Germanny），BL-600 型電子天平（廈門佰倫斯電子科技有限公司）。

1.2 材料及藥品 對(duì)照品：三七皂苷R1（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110745-200415，供含量測(cè)定用）、人參皂苷Re（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110754-200320，供含量測(cè)定用）、人參皂苷Rg1（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)22427-39-0，供含量測(cè)定用）。藥材：三七（批號(hào)：S9219506，購自廣東省藥材公司中藥飲片廠）、三七（批號(hào)：S9218412，購自廣東省藥材公司中藥飲片廠）、三七（批號(hào)：190705，購自廣東省采芝林醫(yī)藥公司）、三七（批號(hào)：180907，購自廣東省采芝林醫(yī)藥公司）、三七（批號(hào)：180608，購自四川薪菊花中藥飲片股份有限公司），上述三七藥材經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院的劉傳明教授鑒定均為五加科三七的干燥根和根莖。試劑：D-101 型大孔吸附樹脂（批號(hào)：HC191026，和誠新材料有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱[9，13,14]：InertSustainTM AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫見表1，流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量10 μl，記錄時(shí)間為70 min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取三七藥材粉末（過60 目篩）2.0 g，置于錐形瓶中，加入70%乙醇50 ml，浸泡30 min，80 ℃恒溫水浴加熱冷凝回流提取1.5 h，過濾，濾液濃縮至2 ml 左右，與適量大孔樹脂（95%乙醇浸泡至無氣泡）混合、拌勻，揮干。D-101 型大孔樹脂柱色譜分離純化，用95%乙醇大孔樹脂浸泡3～4 h 至無氣泡，在色譜柱底部墊一小團(tuán)棉花，裝大孔樹脂層10 cm 左右，純凈水洗至無醇味，壓平大孔樹脂柱層面，加入樣品，放一團(tuán)棉花。洗脫，先用200 ml純凈水洗脫，水洗脫液棄去，再用60 ml 80%乙醇洗脫[3]，洗脫流速為60 滴/min，乙醇洗脫液濃縮至干，用70%甲醇溶解，用5 ml 容量瓶定容，混合均勻，通過0.45 μm 的微孔濾膜，即得。

2.3 參照物的選擇和制備 對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1等三種對(duì)照品，用70%的甲醇配制成每5 ml 均含0.4 mg 的一份混合對(duì)照品溶液和三份單一對(duì)照品溶液。

2.4 測(cè)定法 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄70 min 的色譜圖，即得。以分離度好的、峰形適宜的三七皂苷R1的圖譜峰即8 號(hào)峰為參照物峰，記為S 峰，見圖1。

圖1 參照物色譜圖與三七藥材共有指紋峰指紋圖

2.5 三七指紋圖譜的建立 取10 批次同一來源藥材粉末各1 份，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品，“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜圖相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A 版）”進(jìn)行處理，以全譜和峰面積進(jìn)行匹配，以第六批即S6 色譜圖為參照，完成自動(dòng)匹配數(shù)據(jù)，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，并以其為參照，完成相似度評(píng)價(jià)，10 批樣品的相似度均在0.80 以上，見圖2。共有指紋峰的標(biāo)定：采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰，以圖譜中三七皂苷R1為參照物，將各色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算10 批次指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。其中10 個(gè)色譜峰為各樣品所共有，故標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰。各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為峰-1（0.1722～0.1769）、峰-2（0.2498～0.2535）、峰-3（0.2995～0.3041）、峰-4（0.4055～0.4109）、峰-5（0.4551～0.4604）、峰-6（0.5103～0.5141）、峰-7（0.8324～0.8346）、峰-S（1.0000）、峰-9（1.4172～1.4193）、峰-10（1.5492～1.5546）。同時(shí)以各將各色譜峰峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)峰面積，計(jì)算10 批次指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)峰面積。共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為峰-1（0.1837～0.2777）、峰-2（0.0152～0.1104）、峰-3（0.3015～0.5118）、峰-4（0.1128～0.2807）、峰-5（0.0721～0.1343）、峰-6（0.0428～0.0499）、峰-7（0.0288～0.0638）、峰-S（1.0000）、峰-9（5.6985～5.8728）、峰-10（0.7872～0.8160）。

圖2 相似度計(jì)算（全譜）圖

2.6 方法學(xué)考查

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各次指紋峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果RSD＜3%，表明色譜儀器精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三七藥材粉末6 份，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣，計(jì)算各次指紋峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果RSD＜2.5%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品，按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的指紋峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果RSD＜2.2%，表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 不同來源三七藥材指紋圖譜波動(dòng)范圍的考察

3.1 不同來源三七藥材指紋圖譜制定 取5 批不同來源的藥材粉末各1 份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品，制定指紋圖譜。以圖譜中三七皂苷R1 為參照物峰，將各色譜峰保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間和峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)峰面積，圖譜見圖3。

圖3 5 批不同來源的三七指紋圖譜的比較圖

3.2 不同來源三七藥材指紋圖譜波動(dòng)范圍 對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積歸納分析其波動(dòng)范圍。以各不同來源三七指紋譜各色譜峰保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間和峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為峰-1（0.1736～0.1784）、峰-2（0.2425～0.2548）、峰-3（0.2992～0.3056）、峰-4（0.4058～0.4134）、峰-5（0.4527～0.4597）、峰-6（0.5103～0.5151）、峰-7（0.8324～0.8344）、峰-S（1.0000）、峰-9（1.4167～1.4198）、峰-10（1.5497～1.5546）。各共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為峰-1（0.1567～0.2272）、峰-2（0.0922～0.2097）、峰-3（0.2402～0.4975）、峰-4（0.1569～0.1997）、峰-5（0.1082～0.1405）、峰-6（0.0487～0.0795）、峰-7（0.0494～0.0847）、峰-S（1.0000）、峰-9（4.0436～5.8524）、峰-10（0.4935～0.8973）。

4 討論

在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的通知中，對(duì)于中藥注射劑原料來源上要求動(dòng)、植物藥材均應(yīng)固定品種、藥用部位、產(chǎn)地、采收期、產(chǎn)地加工和炮制方法，礦物藥應(yīng)固定產(chǎn)地和炮制、加工方法[13]。這就要求制定產(chǎn)品藥材的指紋圖譜要求來源加工工藝等要固定，對(duì)于不同來源加工工藝藥材而言，要分別制定指紋圖譜。本試驗(yàn)主要考察不同來源藥材的波動(dòng)范圍，為其質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。本試驗(yàn)通過10 批次同一來源三七藥材指紋圖譜研究分析，制定了其指紋圖譜；本試驗(yàn)通過5 批來源不同的三七考察指紋峰的波動(dòng)范圍；通過初步考察三七藥材指紋峰波動(dòng)范圍，可以初步確定三七藥材指紋圖譜指紋峰波動(dòng)范圍如下：相對(duì)保留時(shí)間分別為峰-1（0.1730～0.1790）、峰-2（0.2400～0.2550）、峰-3（0.2990～0.3060）、峰-4（0.4050～0.4140）、峰-5（0.4520～0.4600）、峰-6（0.5100～0.5160）、峰-7（0.8320～0.8350）、峰-S（1.0000）、峰-9（1.4160～1.4200）、峰-10（1.5490～1.5550）。各共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為峰-1（0.1560～0.2280）、峰-2（0.0920～0.2100）、峰-3（0.2400～0.4980）、峰-4（0.1560～0.2000）、峰-5（0.1080～0.1410）、峰-6（0.0480～0.0800）、峰-7（0.0490～0.0850）、峰-S（1.0000）、峰-9（4.0430～5.8530）、峰-10（0.4930～0.8980）。

本結(jié)果共有峰的相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)范圍較小，而相對(duì)峰面積波動(dòng)范圍較大。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)范圍主要跟儀器方法等有關(guān)，因而其波動(dòng)范圍不會(huì)很大；相對(duì)峰面積波動(dòng)范圍跟成分的含量相關(guān)，不同來源的藥材含量差異越大，波動(dòng)范圍就越大。因此，建立三七藥材HPLC 指紋圖譜的數(shù)字化波動(dòng)范圍對(duì)如何有效把控三七藥材質(zhì)量有一定的參考意義。本試驗(yàn)為藥材的質(zhì)量控制研究提供了可參考試驗(yàn)依據(jù)。但本試驗(yàn)試驗(yàn)樣本數(shù)較少，試驗(yàn)使用的三七均產(chǎn)自云南，因而可進(jìn)一步增加試驗(yàn)樣本數(shù)，收集試驗(yàn)使用的三七藥材產(chǎn)地盡量覆蓋到三七主要產(chǎn)地。

以往建立三七指紋圖譜的研究中，很少對(duì)三七提取液經(jīng)過分離純化后再建立指紋圖譜。本試驗(yàn)參考了三七有效成分分離純化的方法，選用D-101 型大孔樹脂對(duì)三七藥材提取液進(jìn)行分離純化[15]。將純化前后的供試品得到的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果表明，純化后建立的指紋圖譜，5 min 前的峰高、峰面積會(huì)明顯下降，5 min 后的峰的峰高和峰面積降低不明顯，說明純化有利于減少雜質(zhì)的含量。

綜上，本次初步探究獲得的三七藥材指紋圖譜波動(dòng)范圍可對(duì)三七藥材的質(zhì)量控制研究提供試驗(yàn)依據(jù)。