張 科，谷冬梅，李 波，宋 崟，李正翔，袁恒杰

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科1，檢驗(yàn)科2，天津 300052）

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea，PD）是一種青春期女性在月經(jīng)前后或經(jīng)期常見(jiàn)疾病，輕者為下腹疼痛、墜脹，重者會(huì)出現(xiàn)惡心嘔吐、冷汗淋漓甚至昏厥等癥狀，影響患者的正常生活。PD 的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，臨床很難根治[1]。PD 治療以藥物治療為主，常用藥物為非甾體抗炎藥，但治療效果不佳，且不良反應(yīng)明顯[2]。中醫(yī)治療PD 具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，痛經(jīng)在中醫(yī)辨證上屬于“經(jīng)行腹痛”的范疇，是由于氣滯血瘀、經(jīng)血不暢引起的或者是由于著涼受寒所引起的[3]，治則以活血化瘀、行氣止痛為法[4]。當(dāng)歸-川芎是于補(bǔ)血活血、化瘀止痛的經(jīng)典藥對(duì)。當(dāng)歸性溫味甘辛，歸心、肝、脾經(jīng)，善補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)腸通便，并能散寒，凡血虛血瘀有寒癥均宜，為婦科調(diào)經(jīng)之要藥。川芎性溫味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)，善活血行氣，祛風(fēng)止痛，治血瘀氣滯諸痛，兼寒者最宜[5]。近年來(lái)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究中藥多成分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制成為研究熱點(diǎn)，本文擬采用該方法探究當(dāng)歸-川芎藥對(duì)治療PD 的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點(diǎn)的篩選 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“當(dāng)歸”“川芎”為關(guān)鍵詞檢索，收集藥材的化學(xué)成分，然后以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為條件篩選有效成分[6，7]。收集數(shù)據(jù)庫(kù)中成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，并使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 當(dāng)歸-川芎藥對(duì)治療PD 的靶點(diǎn)的篩選 基于Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Primary Dysmenorrhea”為關(guān)鍵詞檢索，收集UC 疾病靶點(diǎn)，以Excel 格式導(dǎo)出，然后將1.1 中成分靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因與疾病靶點(diǎn)基因取交集，作為當(dāng)歸-川芎藥對(duì)治療PD 的靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.1 中成分和靶點(diǎn)信息處理后導(dǎo)入Cytoscape 軟件中繪制活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，然后對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，其中不同類型節(jié)點(diǎn)分別代表有效成分和靶點(diǎn)，邊代表兩者之間的關(guān)系。再根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）和介數(shù)中心性（BC）對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行調(diào)整，節(jié)點(diǎn)的大小反映Degree 的大小。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建及其核心靶點(diǎn)的篩選 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)是從生物化學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳網(wǎng)絡(luò)的角度研究成分和疾病相關(guān)蛋白之間的相關(guān)性[8]。使用在線韋恩圖工具，獲取藥對(duì)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集基因，將交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，導(dǎo)入Cytoscape 軟件，繪制當(dāng)歸-川芎藥對(duì)與PD 靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，再使用“Generate style from statistics”工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色進(jìn)行設(shè)置。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色深淺代表Degree 值的大小，邊的粗細(xì)反映了Combine Score 的大小，從中篩選出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 核心靶點(diǎn)的通路分析 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)能提供系統(tǒng)的生物功能注釋信息，進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和KEGG 通路分析，由此挖掘特定基因或蛋白的生物學(xué)意義[9]。將當(dāng)歸-川芎藥對(duì)治療PD 靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，并限定物種為人，進(jìn)行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，對(duì)生物過(guò)程（P＜0.01）和信號(hào)通路（P＜0.05）進(jìn)行篩選，并進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸-川芎藥對(duì)活性成分的確定 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到“當(dāng)歸”“川芎”得到化學(xué)成分314 個(gè)，其中125 個(gè)來(lái)自當(dāng)歸，189 個(gè)來(lái)自川芎。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 篩選出活性成分9 個(gè)，其中2 個(gè)來(lái)自當(dāng)歸，7 個(gè)來(lái)自川芎，包括β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、葉酸、亞油酸乙酯、楊梅酮、川芎哚、川芎萘呋內(nèi)酯、洋川芎醌堿，具體信息見(jiàn)表1。檢索得到9 個(gè)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)111 個(gè)：β-谷甾醇對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)38 個(gè)，豆甾醇對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)31 個(gè)，谷甾醇對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3 個(gè)，葉酸對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3 個(gè)，亞油酸乙酯對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3 個(gè)，楊梅酮對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)25 個(gè)，川芎哚對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)4 個(gè)，川芎萘呋內(nèi)酯對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)4 個(gè)，洋川芎醌沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。將所得靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，刪除重復(fù)和無(wú)效靶點(diǎn)，共獲取當(dāng)歸-川芎藥對(duì)成分作用靶點(diǎn)69 個(gè)。

表1 當(dāng)歸-川芎中9 個(gè)活性成分的基本信息

2.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括77 個(gè)節(jié)點(diǎn)（8 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)，其中1 個(gè)成分沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，69 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和111 條邊，見(jiàn)圖1。分析網(wǎng)絡(luò)可知，1 個(gè)活性成分平均作用13.88 個(gè)靶點(diǎn)，1 個(gè)靶點(diǎn)平均作用1.61 個(gè)活性成分。從活性成分的角度，8 個(gè)活性成分中作用靶點(diǎn)數(shù)量最多的前3個(gè)成分為DG-1（β-谷甾醇）、DG-2（豆甾醇）、CX-4（楊梅黃酮），分別能與38、31、25 個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。從靶點(diǎn)的角度，度值排名前5 位的是PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRKACA、SCN5A，分別能與6、5、4、3、3 個(gè)活性成分發(fā)生相互作用。

圖1 當(dāng)歸-川芎活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得當(dāng)歸活性成分作用靶點(diǎn)69 個(gè)，川芎活性成分作用靶點(diǎn)42 個(gè)，PD352 個(gè)相關(guān)基因。通過(guò)在線韋恩圖得出當(dāng)歸、川芎與PD 共有基因4 個(gè)，分別是PTGS1、PTGS2、PGR、ADRB2；當(dāng)歸與PD 的共有基因8 個(gè)，分別是BAX、BCL2、CASP3、CHRM2、CHRM3、OPRM1、TGFB1、PLAU；川芎與PD 的共有基因4 個(gè)，分別是ESR1、ESR2、PPARG、KDR。當(dāng)歸-川芎藥對(duì)活性活性成分作用靶點(diǎn)與PD 共有16 個(gè)交集基因，見(jiàn)圖2。

圖2 交集基因的韋恩圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析顯示，PPI 網(wǎng)絡(luò)包含15 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中CHRM3 靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)沒(méi)有連接關(guān)系），34 條邊，平均節(jié)點(diǎn)Degree 值為4.25。網(wǎng)絡(luò)中Degree 值排名前5 的靶點(diǎn)分別是CASP3、PTGS2、ESR1、TGFB1、KDR、PPARG。從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，然后導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，繪制當(dāng)歸-川芎藥對(duì)與UC 靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖3 當(dāng)歸-川芎作用靶點(diǎn)與PD 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 功能注釋分析和富集分析 當(dāng)歸-川芎藥對(duì)與PD 的交集基因共在108 個(gè)（P＜0.05）GO term 上富集，其中生物過(guò)程（BP）78 個(gè)，分子功能（CC）11 個(gè)，細(xì)胞組成（MF）19 個(gè)，見(jiàn)圖4。主要涉及生物學(xué)功能與過(guò)程包括雌二醇調(diào)節(jié)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、NO 生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)等；交集基因共在62 條（P＜0.05）通路上富集，主要通過(guò)調(diào)控雌激素信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等發(fā)揮作用，見(jiàn)圖5。

圖4 GO 富集分析圖

圖5 KEGG 富集分析的16 條通路圖

3 討論

原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制可能與前列腺素水平升高、白細(xì)胞介數(shù)水平升高、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和經(jīng)期體內(nèi)激素水平的變化密切相關(guān)[1]。前列腺素水平升高可使子宮平滑肌的血流量減少，出現(xiàn)收縮甚至痙攣，增加周圍神經(jīng)對(duì)疼痛的敏感性。研究表明[10]，與生殖系統(tǒng)密切相關(guān)的前列腺素是PGE2和PGF2α，在月經(jīng)周期的不同階段子宮內(nèi)膜中二者的含量呈周期性變化。黃體期及月經(jīng)期子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的前列腺類產(chǎn)物增多，黃體期PGE2的含量比PGF2α 高，而月經(jīng)期則相反。此外，原發(fā)性痛經(jīng)與經(jīng)期性激素變化也有關(guān)，雌二醇（E2）可使子宮肌細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流，引起子宮收縮，同時(shí)還可以通過(guò)激活磷酸肌醇循環(huán)，促進(jìn)PGF2α 的合成，降低疼痛閾值。本研究藥對(duì)中當(dāng)歸為氣中之血藥，擅補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛；川芎為血中之氣藥，可活血行氣、祛瘀止痛，二藥配伍，既可補(bǔ)血活血以調(diào)經(jīng)，又能行氣祛瘀以止痛[5]。

本研究活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中當(dāng)歸-川芎藥對(duì)中8 個(gè)活性成分通過(guò)作用于69 個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮藥理作用，同時(shí)網(wǎng)絡(luò)中度值排名前2 個(gè)活性成分分別是β-谷甾醇和豆甾醇，二者均證實(shí)有明顯的抗炎作用。β-谷甾醇通過(guò)提高抗炎因子IL-10 的活性，減小趨化因子和促炎因子活性等抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）的遷移[11]。豆甾醇可明顯減少由脂多糖刺激增多的致炎因子環(huán)氧化酶-2 和誘生型一氧化氮合酶mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而減少PGE2 和NO 的釋放發(fā)揮抗炎作用[12]。從活性成分-疾病交集靶點(diǎn)可知，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)治療原發(fā)性痛經(jīng)是多靶點(diǎn)協(xié)同作用的，如調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子TGFB1 和PTGS2，作用于阿片樣物質(zhì)受體OPRM1 等；GO 富集分析顯示，疾病靶點(diǎn)主要富集在BP 環(huán)節(jié)，如雌二醇調(diào)節(jié)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、NO 生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)等；從DAVID 通路分析顯示，疾病靶點(diǎn)涉及的通路與PD 相關(guān)包括雌激素信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等，其中雌激素信號(hào)通路涉及的靶點(diǎn)有IL6、TNF、SLC2A4、PTPN1、INSR，NF-κB 信號(hào)通路涉及的靶點(diǎn)有TNF、SLC2A4、INSR，細(xì)胞凋亡涉及的靶點(diǎn)有SLC2A4、PTPN1、INSR。

綜上所述，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)中多個(gè)成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)和通路，可發(fā)揮治療PD 的作用。