陸小雙，陳 琴，韓萬(wàn)里，曲延英，陳全家，鄧曉娟

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052)

棉花是全球范圍內(nèi)最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。中國(guó)是目前世界上最大的棉花生產(chǎn)國(guó)，由于海島棉纖維比陸地棉的纖維更長(zhǎng)、更強(qiáng)、更細(xì)，使其成為栽培棉中纖維品質(zhì)最優(yōu)的類(lèi)型，并且是紡高支精梳紗和特種紡織物的關(guān)鍵原料，在紡織工業(yè)中占有重要地位[1]。新疆棉區(qū)作為中國(guó)唯一的海島棉種植及生產(chǎn)基地，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有很重要的地位，棉花生產(chǎn)的興衰對(duì)中國(guó)乃至世界都會(huì)產(chǎn)生十分重要的影響。新疆棉區(qū)雖然具有獨(dú)特的自然條件，適合棉花的種植，但也存在許多問(wèn)題。特別是棉花枯萎病 (Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum.Fov)，近年來(lái)由于連年種植，枯萎病已嚴(yán)重影響海島棉生產(chǎn)，給棉花生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，使新疆海島棉的種植面積和產(chǎn)量都大量減少。因此，因海島棉枯萎病導(dǎo)致減質(zhì)減產(chǎn)的問(wèn)題急需被解決，而解決這一問(wèn)題的有效辦法就是棉花抗病新品種的選擇和培育。海島棉自身枯萎病抗性基因的挖掘是關(guān)鍵點(diǎn)，所以利用生物信息學(xué)、分子遺傳學(xué)和基因工程的方法為海島棉抗枯萎病品種的選育提供候選基因顯得尤為重要。

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸形成了一系列的抗逆機(jī)制，其中，谷胱甘肽途徑在此過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GSTs)是一種多功能酶[4]，是廣泛存在于自然界中的小分子多功能型水溶性蛋白[5]。GSTs一般通過(guò)促進(jìn)還原型谷胱甘肽與各種含親電基團(tuán)底物的相互作用，形成復(fù)合物，將有害物質(zhì)運(yùn)輸至體外，從而起到解毒消毒作用[6]。GST被認(rèn)為是在微生物、動(dòng)植物酶解毒、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他細(xì)胞過(guò)程中起著必不可少的作用[7]。其主要功能之一是能夠提高植物細(xì)胞膜的修復(fù)能力，在基因工程中可用于提高植物的抗逆能力[8]。GST包含一個(gè)N末端域和一個(gè)C末端域。N末端結(jié)構(gòu)域包括谷胱甘肽(GSH)結(jié)合和催化的催化殘基，而保守性較低的C末端結(jié)構(gòu)域(包含5或6個(gè)主要螺旋)結(jié)合疏水性底物并決定GST的特異性和活性[9]。在非生物脅迫反應(yīng)中，GST催化GSH的巰基與外源親電子類(lèi)物質(zhì)結(jié)合來(lái)降低生物細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而保護(hù)植物免受損傷[10]。在病原菌等生物脅迫反應(yīng)中，植物通過(guò)增強(qiáng)GST同源基因的表達(dá)，將有毒物質(zhì)運(yùn)送至液泡加工解毒以減輕對(duì)植物的損傷[11-12]。因此，GST基因在植物抵御各種生物和非生物脅迫的進(jìn)程中均起著非常重要的作用。

課題組前期對(duì)具有高抗枯萎病的海島棉品系06-146與高感枯萎病品種‘新海14’為親本雜交構(gòu)建的F7重組自交系群體中的抗感病品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[13]，測(cè)序結(jié)果提示GSTU7基因可能參與抗枯萎病過(guò)程。本研究以海島棉抗枯萎病材料06-146為試驗(yàn)材料，獲得GbGSTU7基因(CottonFGD登錄號(hào):GB_A03G0575)，對(duì)其核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析。用抗枯萎病材料06-146與感枯萎病材料‘新海14’為試驗(yàn)材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該基因在枯萎病菌侵染下的表達(dá)進(jìn)行研究，旨在探討基因與棉花抗枯萎病之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究海島棉GSTU7基因的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

海島棉抗枯萎病材料06-146，感枯萎病材料‘新海14’，枯萎病菌(生理小種7號(hào))，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供和保存。

1.2 方 法

1.2.1 棉花種植與培養(yǎng)挑選飽滿(mǎn)脫絨種子，1%(體積分?jǐn)?shù))升汞消毒后，無(wú)菌水沖洗多次后將種子置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的發(fā)芽盒中，置于人工氣候室培養(yǎng)(25 ℃恒溫，16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)至芽長(zhǎng)3 cm左右，移至Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)。待第一片真葉完全展開(kāi)時(shí)，接種稀釋至孢子數(shù)為1×107個(gè)·mL-1的枯萎病菌(生理小種7號(hào))。選取0 h及接菌后4、8、12、24和48 h 的棉株下胚軸、莖和葉片，經(jīng)液氮速凍處理，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種鑒定培養(yǎng)基制備。制備馬鈴薯固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，用于棉花枯萎病菌的培養(yǎng)。

病菌培養(yǎng)。挑取枯萎病菌單菌落接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，再將培養(yǎng)后的枯萎病菌接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25 ℃、 r·min-1震蕩培養(yǎng)1周以上，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)菌液濃度達(dá)到1×107個(gè)·cm-2備用。

棉花枯萎病菌侵染棉花。室內(nèi)種植棉花幼苗待2片子葉展平時(shí)，用傷根法完成枯萎病菌對(duì)棉花的侵染。

接種鑒定。在接種3周后開(kāi)始進(jìn)行室內(nèi)病情的調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，待病情穩(wěn)定后調(diào)查發(fā)病率。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)家0～5級(jí)的判斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.2.3 RNA提取與cDNA合成RNA提取采用天根(TIANGEN)生化科技有限公司的RNA提取試劑盒(RNA plant Plus Reagent)，提取后的RNA采用愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(First-Strand cDNA Synthesis Kit) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣品用ddH2O稀釋后，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4GbGSTU7基因的克隆和測(cè)序通過(guò)CottonFGD數(shù)據(jù)庫(kù)得到GSTU7基因的序列，并設(shè)計(jì)用于克隆該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)的引物，引物交由上海華大基因科技有限公司合成。以提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)經(jīng)94 ℃預(yù)變性5 min后，以94 ℃變性30 s，51.6 ℃退火40 s，72 ℃延伸45s為循環(huán)，循環(huán)數(shù)為35個(gè)，最后經(jīng)72 ℃延伸5 min 后終止反應(yīng)，4 ℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)，用Tian Gen公司DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)含有目的DNA 片段的PCR反應(yīng)液進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物與pEASY-T1 (全式金)克隆載體連接，轉(zhuǎn)入Trans-T1 (全式金)感受態(tài)，均勻涂布在含有50 ng·μL-1卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上(酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，定容至1 L)，正置培養(yǎng)1 h后，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證正確后送華大公司測(cè)序。

1.2.5 序列生物信息學(xué)分析用NCBI-ORF FINDER找到測(cè)序序列的開(kāi)放閱讀框，利用ExPAXSyProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白的物理化學(xué)特性，利用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析目的蛋白是否存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，使用EMBL的PFAM(https://pfam.xfam.org/search/sequence)及ExPASy的PROSITE(http://prosite.expasy.org/)對(duì)推導(dǎo)出的GSTU7蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。借助NCBI下載相似性高的基因序列，在Clust Omega(https://www. ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)中進(jìn)行多序列比較。利用MEGA 10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。運(yùn)用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和SWISS MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過(guò)在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件SoftBerryProtComp9.0(http://www.SoftBerry.com)對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用美國(guó)ABI公司7500 Fast System熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以棉花GhUBQ7為內(nèi)參基因，與目標(biāo)基因一起擴(kuò)增，每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，按照abm SYBR qPCR Master Mix試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)目的基因的表達(dá)，所用引物見(jiàn)表1。以棉花UBQ7基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平作為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)抗枯萎病鑒定結(jié)果

對(duì)本研究所涉及的‘新海14’及06-146進(jìn)行室內(nèi)枯萎病接種鑒定，結(jié)果如表2所示，‘新海14’的枯萎病發(fā)病率顯著高于06-146，平均高70%。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[14]，‘新海14’屬于感病材料，06-146屬于抗病材料。

表2 室內(nèi)抗枯萎病鑒定結(jié)果

2.2 目的基因片段的獲得

以06-146的cDNA為模板，利用表1中GSTU7的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到711 bp的目的片段(圖2)。PCR產(chǎn)物純化后連接到Trans-T1載體上(圖2，A)，通過(guò)含有50 ng·μL-1卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基篩選獲得陽(yáng)性克隆菌落(圖2，B)，通過(guò)菌液PCR可以看到含有711 bp的目的條帶(圖2，C)，送往上海華大基因科技有限公司測(cè)序。序列測(cè)定與分析表明，海島棉GSTU7基因含有1個(gè)711 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼236個(gè)氨基酸(圖1)。

圖1 海島棉GSTU7基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence of GSTU7 gene of Island cotton and its encoded amino acid sequence

2.3 GSTU7的氨基酸序列和理化性質(zhì)分析

GbGSTU7蛋白的預(yù)測(cè)分子式是 C1263H1960N324O351S5，相對(duì)分子量約為27.5 ku，等電點(diǎn)7.84。該蛋白中含量最多的氨基酸是賴(lài)氨酸，占氨基酸總數(shù)的9.7%，帶正電荷總體氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)和帶負(fù)電荷總體氨基酸殘基(Asp+ Glu)數(shù)分別為33個(gè)和32個(gè)。親水性平均數(shù)-0.314，推測(cè)其為親水蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)33.48，是不穩(wěn)定蛋白。對(duì)該蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn) GSTU7蛋白不含信號(hào)肽，不存在跨膜區(qū)。將GbGSTU7基因的氨基酸序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，該蛋白屬于tau類(lèi) GST 蛋白。將家族成員基因的蛋白序列載入MAGA-X，使用classX方式完成多序列比對(duì)，采用臨近法完成系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建(圖3)。由進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)：該基因家族共鑒定到32個(gè)成員共分為3類(lèi)。第一類(lèi)共有4個(gè)基因成員，第二類(lèi)共有4個(gè)基因成員，第三類(lèi)共有24個(gè)基因成員，GbGSTU7(GB_A03G0575)屬于該家族第三類(lèi)成員。將該基因序列進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)該基因可能被水楊酸誘導(dǎo)，與還原型谷胱甘肽與大量外源和內(nèi)源性疏水親電試劑的結(jié)合有關(guān)，并且對(duì)某些除草劑具有解毒作用，與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，可能參與的KEGG途徑有谷胱甘肽代謝和毒素分解代謝過(guò)程。

依據(jù)氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果將該蛋白分別與古巴棉(Gossypiumbarbadense) KAB2038401.1、澳洲棉(Gossypiumaustrale)KAA3456760.1、橡膠(Heveabrasiliensis)XP_021652560.1、等植物中的GSTU7基因編碼蛋白做多序列比對(duì)并進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)海島棉GSTU7基因編碼的蛋白序列與亞洲棉、陸地棉、雷氏棉等GSTU7氨基酸序列相似性較高，分別是100%、98.23%、97.88%，與黃連、荔枝、橡膠等物種的GSTU7氨基酸序列相似性較低，均在65%以下(圖4)。

2.4 海島棉GSTU7的生物信息學(xué)分析

對(duì)海島棉GSTU7基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行疏水性/親水性分析，結(jié)果表明該蛋白為親水蛋白。該蛋白第174位的纈氨酸(Val) 親水性最強(qiáng)，其次為第170和第171位的丙氨酸(Ala) 和異亮氨酸(Ile)；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第16位的谷氨酸(Glu)，其次為第14的天冬氨酸(Asp) (圖5)。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含5個(gè)β-折疊和9個(gè)α-螺旋，三級(jí)結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)像呈球狀。海島棉GSTU7基因與毛棉、陸地棉，亞洲棉，雷蒙德氏棉親緣關(guān)系較近，與荔枝、柑橘等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。海島棉、毛棉的GST屬于同一分支，古巴棉、陸地棉、雷氏棉、海島棉、毛棉、亞洲棉、澳洲棉均屬于同一分支，荔枝、柑橘的GST屬于同一分支，橡膠、黃連的GST屬于同一分支(圖6)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)該蛋白既可在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，也可在細(xì)胞核中表達(dá)。

M.DL2000;A.1.PCR純化產(chǎn)物;2.目的基因連接Trans-T1載體之后的質(zhì)粒;B.1-3.陽(yáng)性克隆菌落;C.1-8.菌液PCR結(jié)果;D.1.目的片段 圖2 海島棉GSTU7 基因 PCR 產(chǎn)物電泳分析M. DL2000; A. 1. PCR purified products; 2. The plasmid after the target gene was attached to the trans-T1 vector; B.1-3. Positive colonies; C.1-8. PCR results of bacterial fluid; D.1. Target fragmentFig.2 Electrophoresis analysis of PCR products of Island cotton GSTU7 gene

海島棉H7124數(shù)據(jù)庫(kù)中GST_N_3基因家族成員圖3 家族系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Registration numbers are GST_N_3 gene family members in H7124 database of Island cottonFig.3 Family phylogenetic tree

2.5 枯萎病菌侵染后海島棉GSTU7基因的表達(dá)分析

由圖7可知，正常條件下，海島棉GSTU7基因在棉花的根、莖和葉中均有表達(dá)。

圖7，A、B顯示，在根中，‘新海14’(感病材料)該基因響應(yīng)緩慢，06-146(抗病材料)接菌后立即上調(diào)響應(yīng)，而‘新海14’(感病材料)到24 h才上調(diào)表達(dá)對(duì)抗。接菌后，該基因的表達(dá)量在06-146(抗病材料)的各組織中表現(xiàn)出有規(guī)律的先上升后下降，根、莖、葉中依次表達(dá)，表現(xiàn)出與病菌傳播途徑一致的方向，表明該基因起到了正面抵抗作用?！潞?4’(感病材料)則不同，在根中響應(yīng)緩慢，在莖和葉中呈上升-下降-上升-下降的變化，表現(xiàn)出盲抗反應(yīng)，對(duì)病菌擴(kuò)散未起到持久抑制作用。

GB_A03G0575.1. 海島棉；KAB2038401.1. 古巴棉；KAA3456760.1. 澳洲棉；XP_021652560.1. 橡膠；KDO66687.1. 柑橘；XP_031286334.1. 黃連；EOY33900.1. 可可；XP_012471261.1. 雷氏棉；ALY05896.1. 荔枝；XP_016740535.1. 陸地棉；TYI35251.1. 毛棉；XP_017641138.1. 亞洲棉；KAE8705650.1. 木槿；AT2G29420.1. 擬南芥； 圖6同圖4 海島棉GSTU7與其他植物 GSTU7氨基酸序列的多重比對(duì)GB_A03G0575.1. Gossypium barbadense L； KAB2038401.1. Gossypium barbadense； KAA3456760.1. Gossypium australe；XP_021652560.1. Hevea brasiliensis； KDO66687.1. Citrus sinensis； XP_031286334.1. Pistacia vera； EOY33900.1. Theobroma cacao； XP_012471261.1. Gossypium raimondii； ALY05896.1. Litchi chinensis； XP_016740535.1. Gossypium hirsutum；TYI35251.1. Gossypium tomentosum； XP_017641138.1. Gossypium arboreum； KAE8705650.1. Hibiscus syriacus； AT2G29420.1. Arabidopsis thaliana； The same as Fig.6Fig.4 Multiple alignment of the amino acid sequences of Island cotton GSTU7 and other plant GSTU7

圖7，C-E顯示，在06-146(抗病材料)中，隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)，GbGSTU7基因在根中的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，在莖和葉中的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在處理24 h時(shí)莖的表達(dá)量達(dá)到最高。接菌24 h時(shí)，海島棉GSTU7基因在莖和葉中的表達(dá)量較接菌4 h有明顯上升，但根中的表達(dá)量明顯下降。在‘新海14’(感病材料)中，枯萎病菌侵染后4 h時(shí)，海島棉GSTU7基因在根和莖中的表達(dá)量較0 h無(wú)明顯變化，但在葉片中的表達(dá)量達(dá)到最高，隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)，海島棉GSTU7基因在‘新海14’(感病材料)根中的表達(dá)量呈下降-上升的趨勢(shì)，葉中的表達(dá)量呈上升-下降-上升的趨勢(shì)，且在處理8 h時(shí)莖的表達(dá)量達(dá)到最高。

Val. 纈氨酸；Glu. 谷氨酸圖5 海島棉GSTU7 氨基酸序列的親水性和疏水性分析Val. Valine acid；Glu. Glutamic acidFig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of GSTU7 amino acid sequence of Island cotton

圖6 海島棉與其他植物 GSTU7 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of GSTU7 amino acid sequences of Island cotton and other plants

3 討 論

前人研究表明，植物在遭遇逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的活性氧含量會(huì)大量升高，會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝物質(zhì)造成氧化傷害，嚴(yán)重影響甚至擾亂植物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝[15-16]。清除活性氧的過(guò)氧化物酶系在生物體內(nèi)普遍存在，包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glu-tathione peroxidase，GPX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、過(guò)氧化氫酶(catalase， CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)，能夠有效地清除植物體內(nèi)的活性氧及其他自由基，消除細(xì)胞內(nèi)的有害代謝物質(zhì)，從而保護(hù)植物免受或減緩傷害[17]。其中，GST作為一個(gè)大的基因家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境變化的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[18]。GSTs對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素有很高的親和力，在茄屬植物中，受病原真菌侵染的植物表現(xiàn)GST含量隨著細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素水平的增加而快速增加[19]，這表明GSTs在激素穩(wěn)態(tài)和植物抵御病原菌中起著重要作用[20]?？裹S萎病棉花品種‘農(nóng)大601’，在病毒誘導(dǎo)基因沉默抑制GST基因簇后極易感病，這表明GST簇在黃萎病抗性中起重要作用[21]。因此，研究GST有助于闡明植物生長(zhǎng)和抵御脅迫的分子機(jī)制，對(duì)改善脅迫下植物的生存能力具有實(shí)際意義。

A.06-146；B. 新海14；C.根；D.莖；E.葉； *表示P<0.05，**表示P<0.01圖7 海島棉GSTU7基因在枯萎病菌侵染后不同材料及組織的表達(dá)A. 06-146; B. Xinhai 14; C.Root;D.Stem; E. Leaves. * Indicates P<0.05, ** Indicates P<0.01Fig.7 Expression of GSTU7 gene of Island cotton in different materials and tissues after infection by Fusarium wilt

GSTs一般以25～27 kD的2條亞基的同源或異源方式聚合而成，每個(gè)亞基都含有2個(gè)空間結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)域：N端由β折疊和α螺旋構(gòu)成；C端主要由α螺旋構(gòu)成[18]。本研究克隆獲得的海島棉GSTU7基因?qū)儆趖au類(lèi)GST家族成員，其編碼的蛋白質(zhì)與其他物種中GST序列相似性較低，但在結(jié)構(gòu)上相對(duì)保守，N端具有保守的結(jié)合谷胱甘肽的G位點(diǎn)，C端的H位點(diǎn)可結(jié)合疏水底物[5]，在空間結(jié)構(gòu)上與前人研究結(jié)果類(lèi)似，N端主要由β折疊和α螺旋構(gòu)成(βαβαββα)，C端由6個(gè)α螺旋構(gòu)成，通過(guò)1個(gè)約11個(gè)氨基酸的短序列與N端結(jié)構(gòu)域連接。

研究發(fā)現(xiàn)，玉米中大多數(shù)GST基因在根中表達(dá)水平較高，而在其他組織中表達(dá)相對(duì)較低[22]。本研究中，海島棉GSTU7基因在棉花各組織中表達(dá)差異明顯，莖中的表達(dá)量最高，其次是葉，在根中的表達(dá)量較低，呈現(xiàn)明顯的組織特異性。前人研究表明，干旱、真菌攻擊、鹽脅迫等均能誘導(dǎo)GSTs的表達(dá)[21, 23-25]。過(guò)表達(dá)大豆GmGSTL基因提高了煙草和擬南芥在鹽脅迫下的存活率[7]。擬南芥中過(guò)表達(dá)番茄GST基因增強(qiáng)了其在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的生長(zhǎng)勢(shì)[26]。煙草過(guò)表達(dá)GhGST結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)黃萎病的抗性明顯增強(qiáng)，棉花抗病品種在病毒誘導(dǎo)基因沉默抑制GST基因簇后極易感病[21]。這表明，GSTs 在植物抵御不良環(huán)境和損傷等方面也起著重要作用。

本研究結(jié)果表明，克隆的海島棉GSTU7基因?qū)儆贕ST家族tau類(lèi)成員，枯萎病菌侵染后，該基因在抗病材料06-146和感病材料‘新海14’的各組織均可響應(yīng)誘導(dǎo)，并且在根、葉中均存在顯著差異，莖中存在極顯著差異。在抗病材料06-146莖中的表達(dá)量最高，其次是葉，在根中的表達(dá)量較低，具有明顯的組織特異性。說(shuō)明該基因可在植物體遭受枯萎病菌侵染時(shí)，各組織隨著病原菌的擴(kuò)散做出應(yīng)答，推測(cè)其可能與棉花抗枯萎病有著密切的關(guān)系，可能在棉花抵御病菌侵染的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為鑒定海島棉GSTU7基因功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。