肖玉娟 甘美裕 林俊杰 莊峙廈 何少貴 傅 奇

(廈門華廈學院環(huán)境與公共健康學院，廈門 361024)

DHA是一種具有多種生理功能的多不飽和脂肪酸[1-3]，在食品、藥品以及飼料等領域得到廣泛應用[4-6]。DHA的主要來源包括深海魚類和微生物[7]，其中利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA由于生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、培養(yǎng)條件簡單、可規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點，已成為DHA最主要的來源之一[8-10]。

破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)包括Aurantiochytrium、Schizochytrium、Oblongichytrium等屬[11]，其中Aurantiochytrium和Schizochytrium屬的多個種可以生產(chǎn)DHA[12, 13]，2010年，我國批準了Schizochytrium屬生產(chǎn)的DHA藻油作為新資源食品(衛(wèi)計委2010年第3號令)。Chang等[14]的研究表明，Aurantiochytrium屬菌種與Schizochytrium屬菌種相比，在培養(yǎng)基利用和脂肪酸生產(chǎn)上具有自身的特色和優(yōu)勢，同一屬的不同菌株在DHA表達上也有較大的差異，篩選產(chǎn)DHA的不同種類破囊壺菌具有一定的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

分離菌株樣本為腐木，采集于廈門市集美區(qū)紅樹林，置于4 ℃冷藏[15]。

1.1.2 試劑

2216E(液體)；2216E瓊脂；葡萄糖(食品級)；酵母浸粉；海水晶；谷氨酸鈉、維生素B1、維生素B12、泛酸鈣、氨水(25%～28%)、乙醇、石油醚：分析純，DHA甲酯標準品(色譜純)；真菌DNA提取試劑盒；ITS擴增引物ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.2 儀器與設備

Aeris-bg096型PCR儀，HE99型核酸電泳儀，211B型搖床，LRH-250型生化培養(yǎng)箱，Quanta450型掃描電鏡，GC-2010plus型島津氣相色譜，GUJS-50L型發(fā)酵罐，BL-18X型真空冷凍干燥器。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取腐木25 g加入225 mL 2216E液體培養(yǎng)基拍打均質(zhì)，4層紗布過濾后，于外加3%葡萄糖的2216E瓊脂平板稀釋涂布，28 ℃培養(yǎng)72 h，取細胞直徑顯著大于釀酒酵母的球狀菌菌落劃線純化[15]。

1.3.2 細胞形態(tài)觀察

純化后的菌株接種至添加3%葡萄糖的2216E液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，0.22 μm濾膜過濾收集細胞，取濾膜進行掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3.3 菌種鑒定

用真菌基因組DNA抽提試劑盒，提取菌株的總DNA；用ITS引物擴增(具體的引物序列)，所得PCR產(chǎn)物電泳純化后進行測序。

ITS擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將測序結(jié)果在Genbank進行比對，選擇相似度較高的菌種序列，分別用BioEdit[16]和Clustal X[17]進行比對和編輯，取有效區(qū)間，采用最大簡約算法，用Paup* 4.0構(gòu)建進化樹[18, 19]，選擇AspergillusnigerATCC 16888[20]作為外群。

1.3.4 發(fā)酵

由于破囊壺菌對氧、補料和pH控制要求較高，為了保證脂肪酸組成分析結(jié)果與工業(yè)生產(chǎn)過程相一致，使用50 L發(fā)酵罐進行菌體培養(yǎng)，并結(jié)合文獻報道與預實驗結(jié)果選擇發(fā)酵條件。

種子培養(yǎng)基使用成品2216E液體培養(yǎng)基加入3%葡萄糖，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基[21, 22]：葡萄糖 5 g/L，酵母浸粉 5 g/L，谷氨酸鈉 10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，海水晶 12 g/L，維生素B10.009 5 g/L，維生素B120.000 15 g/L，泛酸鈣 0.003 2 g/L。

50 L發(fā)酵罐中初始裝液量為25 L；接種量為10%；發(fā)酵溫度為30 ℃；4h后流加飽和葡萄糖溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)窃? g/L，96 h停止補料；10%磷酸和氨水控制pH在5.5～6.5；初始攪拌速度為200 r/min，初始通氣比為1∶0.5，通過調(diào)節(jié)攪拌速度和通氣量控制溶解氧(DO)在12 h內(nèi)不低于20、40 h內(nèi)不低于5，40 h后保持在0左右[23]；98 h放罐，每4 h取樣測發(fā)酵液殘?zhí)?，? h取樣檢測發(fā)酵液中生物量及細胞中的總脂肪酸和DHA含量。

1.3.5 生物量、殘?zhí)桥c油脂檢測

生物量：取發(fā)酵液100 mL于8 000 r/min離心，棄上清液后，去離子水振蕩洗滌2次，真空冷凍干燥2 d稱質(zhì)量。

殘?zhí)牵篋NS法測定發(fā)酵液中葡萄糖[24]。

總脂肪：按照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》酸水解法測定總脂肪。

脂肪酸測定：提取的總脂肪按照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》皂化并甲酯化后，按照外標法測定DHA[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

從海水腐木中篩選得到一株球狀真菌，菌落白色、濕潤，編號為HX2019010，細胞形態(tài), HX2019010細胞掃描電鏡圖如圖1所示，放大倍數(shù)為6 000倍，左側(cè)為年輕細胞，右側(cè)中褶皺較多的細胞為老齡細胞。

圖1 HX2019010細胞掃描電鏡圖

2.2 菌種鑒定

菌株HX2019010 ITS序列經(jīng)測序拼接后，得到460 bp有效序列，于Genbank進行比對發(fā)現(xiàn)該序列與Aurantiochytrium、Schizochytrium、Thraustochytrium等破囊壺菌科菌株相似度相對較高。選擇相似度較高的菌株ITS序列構(gòu)建進化樹, 基于ITS序列的進化樹如圖2所示。

樹長為2 290，一致性指數(shù)(CI)為0.527，保留指數(shù)(RI)為0.774，同性指數(shù)(HI)為0.473。各分枝自展值較高，樹形結(jié)構(gòu)可靠，其中HX2019010菌株與Aurantiochytrium聚合在一枝。但值得注意的是該菌株ITS序列與Genbank中現(xiàn)有ITS序列全序列相似度較低，相似度最高的AurantiochytriumlimacinumIMB177、AurantiochytriumlimacinumIMB181菌株也僅有部分區(qū)域相似度達92%，不足以判定為同一個種，因此，結(jié)合細胞形態(tài)，初步鑒定為Aurantiochytriumsp. HX2019010。ITS序列上傳至Genbank，序列號為MN931688。

2.3 發(fā)酵曲線

發(fā)酵過程中pH、DO、殘?zhí)?、生物量、總脂肪和DHA含量曲線, 菌株HX2019010發(fā)酵曲線如圖3所示，此批曲線僅用于標示后續(xù)用于脂肪酸組成分析所用細胞的制備過程，不代表最優(yōu)發(fā)酵條件。

圖2 基于ITS序列的進化樹

從圖3可以看出，菌株HX2019010在此培養(yǎng)條件下快速生長并合成DHA，接種后8 h左右進入對數(shù)生長期，56 h后細胞中脂肪大量積累。98 h發(fā)酵后，生物量可達108.27 g/L；干細胞中總脂肪含量達26.26%，發(fā)酵液中脂肪含量達28.43 g/L；DHA占細胞干質(zhì)量的8.47%，發(fā)酵液中DHA含量達9.17 g/L。

圖3 菌株HX2019010發(fā)酵曲線

從總脂肪與DHA增長曲線可以看出，后期總脂肪和DHA都在積累，但DHA在脂肪酸中的比例有所降低，與裂殖壺菌發(fā)酵過程中后期DHA大量積累有顯著差異[26-28]，可能系培養(yǎng)條件更有利于Aurantiochytriumsp. HX2019010積累其他脂肪酸組分或不利于其他脂肪酸向DHA轉(zhuǎn)化，后續(xù)將繼續(xù)對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

2.4 脂肪酸組成

發(fā)酵罐中培養(yǎng)48 h和98 h的Aurantiochytriumsp. HX2019010細胞離心、洗滌，真空冷凍干燥48 h后，按照GB 5009.168—2016外標法進行測定，脂肪酸含量以每100 g干細胞中的脂肪酸質(zhì)量計，Aurantiochytriumsp. HX2019010脂肪酸組成見表1。Aurantiochytriumsp. HX2019010細胞主要脂肪酸組成為棕櫚酸(35.57%～37.41%)、DHA(32.25%～45.86%)和肉豆蔻酸(7.43%～9.22%)。發(fā)酵98 h后細胞中各種脂肪酸含量普遍高于48 h細胞，總脂肪酸含量增加103.42%，其中棕櫚酸增加93.37%，肉豆蔻酸增加152.35%，DHA增加43.07%。在發(fā)酵后期，DHA積累相對較少，表明DHA的合成受到抑制，可能與氧、有機氮源和生物素供應不足以及培養(yǎng)溫度有關(guān)[29]。

菌株Aurantiochytriumsp. HX2019010胞內(nèi)脂肪酸中DHA比例波動較大，較高值可達45.86%，高于商業(yè)化生產(chǎn)DHA的裂殖壺菌SchizochytriumlimacinumSR21中DHA比例(32%～40%)，但胞內(nèi)總油脂含量較低[23]。與牟桐等[30]篩選的6株破囊壺菌相比，飽和脂肪酸棕櫚酸和肉豆蔻酸含量較高，但總油脂產(chǎn)量也較高。與李晶晶等[31]篩選的破囊壺菌Sw7菌株脂肪酸組成較為相似，總脂肪酸含量較低，但發(fā)酵液中細胞密度顯著較高。

表1 Aurantiochytrium sp. HX2019010脂肪酸組成

綜合分析，菌株Aurantiochytriumsp. HX2019010在發(fā)酵罐中可實現(xiàn)高密度發(fā)酵，且DHA占總脂肪酸含量較高，DHA產(chǎn)量顯著高于已報道的Aurantiochytrium屬菌株[29]，具有進一步研究的價值，但細胞中油脂含量較低，且發(fā)酵后期DHA積累較少，有待于進一步優(yōu)化發(fā)酵條件。

3 結(jié)論

從廈門市集美區(qū)海水腐木中篩選得到一株產(chǎn)DHA的球狀真菌HX2019010，經(jīng)ITS序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合掃描電鏡觀察，初步鑒定為Aurantiochytriumsp. HX2019010。該菌株在50 L發(fā)酵罐中可實現(xiàn)較高密度的發(fā)酵，98 h培養(yǎng)后發(fā)酵液中生物量可達108.27 g/L，脂肪含量達28.43 g/L，DHA含量達9.17 g/L。細胞中脂肪酸主要成分為棕櫚酸、DHA和肉豆蔻酸，含量與比例受發(fā)酵時間或培養(yǎng)條件的影響，其中DHA占總脂肪酸的32.25%～45.86%，具有進一步研究的價值。該菌株ITS序列與Genbank中現(xiàn)有破囊壺菌序列存在較大差異，不排除其為Aurantiochytrium新種的可能性，有待進行全基因組平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity, ANI)分析。