黃 銳，王 劍△，譚 慧，周利平，楊化冰，劉 娟

1.利川市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北利川 445400;2.恩施州中心醫(yī)院西醫(yī)部藥劑科，湖北恩施 445000

急性心血管事件是人類死亡的主要原因之一，伴隨人口老齡化的加重，心血管疾病的發(fā)生率逐年增加[1-3]。心肌缺血再灌注可加重心肌細(xì)胞甚至心臟結(jié)構(gòu)的損傷，嚴(yán)重影響心臟功能[4-6]。心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的重要原因[7-8]。因此，降低心肌細(xì)胞凋亡率是預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種高度保守的單鏈內(nèi)源性RNA，長度超過200個核苷酸[9-10]。lncRNA廣泛參與調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞的發(fā)育、增殖、衰老、凋亡等進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-12]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞損傷伴隨lncRNA表達(dá)譜的改變，lncRNA表達(dá)增加或降低可導(dǎo)致心律失常、心肌肥大、心肌梗死等各種心臟疾病[13]。全血lncRNA的表達(dá)水平是診斷心血管疾病的重要標(biāo)志物[14]。RPA3-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，RPA3-AS1在人類疾病特別是心血管疾病的關(guān)系尚不明確。本研究旨在探討RPA3-AS1是否在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用，探究RPA3-AS1在心肌細(xì)胞中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標(biāo)本 收集2019年1月至2020年6月利川市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科治療的43例急性心肌缺血患者(患者組)全血標(biāo)本，以及同期43例體檢健康者(健康組)全血標(biāo)本。本研究得到利川市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞與試劑 人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16購于中科院上海細(xì)胞庫。高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司。實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen公司。噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。TRizol裂解液購于美國Sigma公司。載有RPA3-AS1序列的質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購于上海和元生物技術(shù)股份公司。一抗和二抗購于美國Abcam公司。Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。將對數(shù)生長期AC16細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到60%時，根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染載有RPA3-AS1序列的質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)和陰性對照質(zhì)粒(對照組)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2qPCR檢測 RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表達(dá) 采用TRIzol-氯仿-異丙醇體系提取全血標(biāo)本和細(xì)胞系總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 6 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA相對表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參檢測RPA3-AS1和BAG3 mRNA的表達(dá)；以U6為內(nèi)參檢測miR-203a-3p的表達(dá)。引物序列如下，miR-203a-3p正向引物：CCG GTG AAA TGT TTA GGA CCA CTA G，反向引物：GCC GCG TGA AAT GTT TAG G；GAPDH正向引物：CTG GGC TAC ACT GAG CAC C，反向引物：AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG；BAG3正向引物：AGC TCC GAC CAG GCT ACA TT，反向引物：GGA TAG ACA TGG AAA GGG TGC。U6正向引物：CTC GCT TCG GCA GCA CA，反向引物：AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT。

1.2.3MTT法檢測AC16細(xì)胞活力 將對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個細(xì)胞，每孔加入200 μL培養(yǎng)基。分別在接種后第1、2、3、4、5 d兩組的細(xì)胞活性。MTT檢測時，在各孔細(xì)胞中加入20 μL MTT試劑(濃度為5 g/L)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸去液體，各孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫下在震蕩搖床振蕩至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值(反映細(xì)胞活力)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測AC16細(xì)胞凋亡率 收集對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，采用PBS溶液洗3次，采用binding buffer重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度。分別取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC并混勻，加入5 μL PI并混勻，在培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)15 min。加入100 μL binding buffer并混勻，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5生物信息學(xué)方法預(yù)測RPA3-AS1的作用機(jī)制 采用生物信息學(xué)軟件starBase v2.0預(yù)測RPA3-AS1可配對結(jié)合的miRNA。采用生物信息學(xué)軟件miRWalk 2.0和DIANA-microT預(yù)測miR-203a-3p可配對結(jié)合的靶基因mRNA。

1.2.6Western blot法檢測BAG3蛋白和相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá) 采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，檢測蛋白濃度，每組取35 μg總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳。硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜后，采用5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗在4 ℃下孵育過夜。洗膜后，加入二抗在室溫下孵育2 h。滴加ECL發(fā)光液，在成像系統(tǒng)中采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1兩組受試者全血中RPA3-AS1的表達(dá) 健康組和患者組全血中RPA3-AS1的相對表達(dá)水平分別為6.19±0.57和1.35±0.41，與健康組相比，患者組全血RPA3-AS1的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：與健康組相比，aP<0.01。

2.2兩組AC16細(xì)胞中RPA3-AS1的表達(dá) 健康組和患者組AC16細(xì)胞中RPA3-AS1相對表達(dá)水平分別為1.01±0.07和9.91±1.27，患者組RPA3-AS1相對表達(dá)水平顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3高表達(dá)RPA3-AS1抑制AC16細(xì)胞活力 MTT法結(jié)果顯示，從第2 天起，患者組AC16細(xì)胞活力顯著高于健康組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與健康組相比，bP<0.05，aP<0.01。

2.4高表達(dá)RPA3-AS1抑制AC16細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后，患者組和健康組AC16細(xì)胞凋亡率分別為(3.93±0.62)%和(10.76±1.48)%，與健康組相比，高表達(dá)RPA3-AS1顯著抑制AC16細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

注：與健康組相比，aP<0.01。

2.5生物信息學(xué)方法預(yù)測RPA3-AS1的作用機(jī)制 采用生物信息學(xué)軟件starBase v2.0預(yù)測RPA3-AS1可配對結(jié)合miR-203a-3p。采用生物信息學(xué)軟件miRWalk 2.0和DIANA-microT預(yù)測miR-203a-3p可配對結(jié)合BAG3 mRNA。見圖4。

圖4 生物信息學(xué)方法預(yù)測RPA3-AS1的作用機(jī)制

2.6高表達(dá)RPA3-AS1的AC16細(xì)胞中miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，患者組和健康組AC16細(xì)胞miR-203a-3p的相對表達(dá)水平分別為0.26±0.04和1.03±0.14，高表達(dá)RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表達(dá)(P<0.01)?；颊呓M和健康組AC16細(xì)胞BAG3mRNA的相對表達(dá)水平分別為4.59±0.56和1.03±0.08，miR-203a-3p表達(dá)水平降低后，BAG3 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.7高表達(dá)RPA3-AS1促進(jìn)BAG3蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，高表達(dá)RPA3-AS1的AC16細(xì)胞中，BAG3蛋白表達(dá)水平明顯升高，BAG3蛋白表達(dá)水平升高后，細(xì)胞中Bcl-2和p53蛋白表達(dá)水平升高，Bax和Caspase-8蛋白表達(dá)水平降低。見圖5。

圖5 Western blot法檢測BAG3蛋白及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)情況。

3 討 論

lncRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響細(xì)胞的各種生命進(jìn)程[15-16]。越來越多的lncRNA如H19、AK139328、TUG1、KCNQ1OT1、MALAT1等被證實(shí)與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[17-20]。RPA3-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究中，通過檢測健康組和患者組全血標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，RPA3-AS1在患者組全血標(biāo)本中的表達(dá)明顯低于健康組，表明其可能在心肌缺血中發(fā)揮重要作用，可能與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)。臨床研究表明，心肌細(xì)胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的主要因素[21-22]。本研究結(jié)果表明，心肌細(xì)胞高表達(dá)RPA3-AS1后，心肌細(xì)胞的活力顯著增加，心肌細(xì)胞的凋亡率顯著降低，RPA3-AS1可增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力并抑制其凋亡。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA主要通過以不完全互補(bǔ)配對的方式與微小RNA(miRNA)結(jié)合，抑制miRNA與靶基因mRNA的配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)miRNA靶基因的表達(dá)[23]。本研究通過生物信息學(xué)軟件starBase v2.0預(yù)測，RPA3-AS1可配對結(jié)合miR-203a-3p。miR-203a-3p可促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥，沉默miR-203a-3p可下調(diào)心肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，降低心肌細(xì)胞的凋亡率[24]。本研究結(jié)果表明，高表達(dá)RPA3-AS1后，人心肌細(xì)胞中miR-203a-3p表達(dá)水平降低，RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表達(dá)。本研究通過生物信息學(xué)軟件miRWalk 2.0和DIANA-microT預(yù)測，miR-203a-3p可配對結(jié)合Bcl-2相關(guān)抗凋亡蛋白3(BAG3)mRNA。BAG3蛋白是一種高度保守的熱休克蛋白70(HSP70)分子結(jié)合伴侶，屬于抗凋亡基因(BAG)家族蛋白，可在多個水平調(diào)控細(xì)胞的活性、凋亡、轉(zhuǎn)移等生理過程[25]。BAG3蛋白可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，BAG3蛋白表達(dá)缺失與缺血再灌注心肌損傷密切相關(guān)[26]。本研究結(jié)果表明，miR-203a-3p表達(dá)降低后，人心肌細(xì)胞中BAG3基因表達(dá)顯著升高，表明miR-203a-3p可能發(fā)揮抑制BAG3基因表達(dá)的作用。Bcl-2和p53蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax和Caspase-8蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，因此，Bcl-2、p53、Bax和Caspase-8蛋白表達(dá)水平可反映細(xì)胞凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)RPA3-AS1后，人心肌細(xì)胞中Bcl-2和p53蛋白表達(dá)升高，Bax和Caspase-8蛋白表達(dá)降低，提示RPA3-AS1可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，從而可能預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷。本課題組下一步將通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)RPA3-AS1與miR-203a-3p及miR-203a-3p與BAG3 mRNA之間的配對結(jié)合。

lncRNA RPA3-AS1可能通過調(diào)控miR-203a-3p/BAG3分子軸促進(jìn)人心肌細(xì)胞的活性并抑制其凋亡。本研究首次揭示RPA3-AS1在人心肌缺血再灌注損傷中的作用及可能的作用機(jī)制，為RPA3-AS1的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。