程招敏，藍(lán) 鍇，王云秀，黎小瓊，柯培鋒△，李 亮

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510120；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，廣西南寧530200

無乳鏈球菌又稱為B群鏈球菌(GBS),是育齡期女性的直腸和生殖道中常見的定植菌。妊娠晚期無乳鏈球菌的定植，是引起產(chǎn)婦宮內(nèi)感染和嚴(yán)重新生兒感染的主要原因[1]。了解育齡期女性中定植無乳鏈球菌的耐藥特點(diǎn)和分子流行特征，對妊娠不良結(jié)局的防控有重要作用。通過多位點(diǎn)序列分型(MLST)可將無乳鏈球菌分為不同的序列型(ST)，并歸為不同的克隆群(CC)。大多數(shù)人源菌株源于5個CC(CC1、CC10、CC17、CC19、CC23)[2]。國外研究表明，CC103菌株主要引起奶牛乳腺炎[3]，然而2015-2017年，國內(nèi)人源性CC103菌株的分離率從1.25%增加至21.74%，尤其是ST485已成為主要的人源性ST之一，且分離率明顯高于國外的報道[2-4]。然而，國內(nèi)關(guān)于人源性CC103菌株主要流行的ST，以及其耐藥性、分子流行病學(xué)研究鮮有報道。本研究擬對廣州地區(qū)妊娠期女性定植CC103無乳鏈球菌的ST分布進(jìn)行分析，并對其耐藥性、主要耐藥基因、血清型分布及主要毒力基因進(jìn)行調(diào)查，旨在為該地區(qū)CC103菌株引起感染的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究收集的137株無乳鏈球菌均為非重復(fù)菌株，分離于2018-2019年在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的妊娠期女性的陰道-直腸拭子標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8739和肺炎鏈球菌ATCC49619購于美國典型菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株無乳鏈球菌ATCC12403和A909由南華大學(xué)陳麗麗老師惠贈。

1.2儀器與試劑 水解酪蛋白(M-H)瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板(江門凱琳公司)、藥敏紙片(英國Oxoid公司)、細(xì)菌基因組DNA提取和Premix Taq試劑盒(大連TakaRa公司)、VITEK MS質(zhì)譜儀及相關(guān)試劑(法國bioMérieux公司)、VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀及相關(guān)檢測試劑(法國bioMérieux公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、核酸凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。本實驗MLST、血清學(xué)分型、耐藥基因和毒力基因檢測所需的引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1菌株復(fù)蘇及鑒定 將收集的試驗菌株轉(zhuǎn)種于血平板上，在37 ℃、5.00% CO2條件下，孵育24 h，同時采用VITEK MS質(zhì)譜儀和VITEK-2細(xì)菌鑒定儀對所有試驗菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.2DNA提取 細(xì)菌基因組DNA提取參照試劑說明書的要求和操作步驟進(jìn)行，提取的DNA置于-80 ℃待用。

1.3.3MLST分型 參照J(rèn)ONES等[5]報道的實驗條件和方法，采用PCR技術(shù)對adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt等7個管家基因進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序分析。運(yùn)用MEGA6軟件對所獲取的所有試驗菌株的同一基因進(jìn)行剪齊，將經(jīng)過剪齊的序列上傳至MLST分型在線數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/sagalactiae/)，獲取各菌株各管家基因的等位基因數(shù)，通過7個管家基因的等位基因數(shù)確定各菌株的序列型。用eBURST3.1軟件對所有序列型進(jìn)行分析并歸為不同CC。

1.3.4抗菌藥物敏感試驗 參照2019版美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感試驗指南(http://www.clsi.org)的試驗要求和藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，檢測各試驗菌株對青霉素(10 μg)、紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、四環(huán)素(30 μg)、氯霉素(30 μg)、利奈唑胺(30 μg)、萬古霉素(30 μg)等7種抗菌藥物的敏感性。藥敏試驗質(zhì)控菌株根據(jù)CLSI要求，采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619。

1.3.5耐藥基因檢測 采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增CC103菌株的紅霉素和克林霉素耐藥基因(ermB、mefA/E、ermTR基因、linB基因)，反應(yīng)條件和引物采用何其勵等[6]的報道，根據(jù)各菌株擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定其是否攜帶耐藥基因。

1.3.6毒力基因檢測 采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增CC103菌株的主要毒力基因:CAMP因子基因(cfa)、α-C蛋白基因(bca)、β-C蛋白基因(bac)、5Ca肽酶基因(scpB)和層黏連蛋白基因(lmb)。引物和反應(yīng)條件參照J(rèn)IANG等[7]的報道，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定各菌株是否攜帶毒力基因。

1.3.7分子血清學(xué)分型 參照IMPERI等[8]建立的方法，采用多重PCR技術(shù)，擴(kuò)增莢膜多糖(CPS)合成基因，通過瓊脂糖凝膠電泳確定各CC103菌株的血清型。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12403(血清學(xué) Ⅲ型)和A909(血清學(xué)Ⅰa型)為血清分型的參考菌株。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 藥敏試驗結(jié)果用WHONET5.6軟件統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS22.0軟件進(jìn)行，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株鑒定 收集的137株試驗菌株，均同時采用VITEK MS質(zhì)譜儀和VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定，其結(jié)果均為無乳鏈球菌。

2.2MLST分型結(jié)果 MLST分型結(jié)果如圖1所示，137株無乳鏈球菌被分為19種ST，以ST19和ST17為主，分別占28.50%和13.10%，其他主要的ST包括ST485、ST862、ST651、ST27等，19種ST來源于7個CC。CC103占26.30%(36/137)，共發(fā)現(xiàn)4種來源于CC103的ST,分別為ST485(9.50%)、ST862(7.30%)、ST651(7.30%)、ST103(2.20%)。此外，聚類分析顯示ST485與ST862，ST651與ST103的親緣關(guān)系更近。

圖1 19種ST無乳鏈球菌的聚類分析圖

2.3抗菌藥物敏感試驗結(jié)果 137株無乳鏈球菌對青霉素、利奈唑胺和萬古霉素均敏感(敏感率為100.00%)。CC103對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素、四環(huán)素的耐藥情況見表1。CC103菌株對紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素耐藥率與非CC103菌株比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，即CC103菌株紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率低于非CC103菌株。ST651和ST862對紅霉素、克林霉素和氯霉素的耐藥率以及兩者的多重耐藥率均>60.00%。

表1 人源性CC103無乳鏈球菌與非CC103菌株的耐藥性比較[n(%)]

2.4耐藥基因檢測結(jié)果 耐藥基因擴(kuò)增后電泳圖見圖2。對紅霉素耐藥的ST651菌株ermB基因陽性率為100.00%(7/7)，未檢出mefA/E和ermTR兩種耐藥基因；對紅霉素耐藥的ST862菌株ermB和mefA/E基因的陽性率均為100.00%(8/8)，未檢出ermTR基因；對克林霉素耐藥的所有CC103菌株，linB基因陽性率為100.00%(14/14)。

注：a為ermB基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2為陽性標(biāo)本；b為mefA/E基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2和3為陽性標(biāo)本；c為linB基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2為陽性標(biāo)本。

2.5分子血清學(xué)分型結(jié)果 分子血清學(xué)分型的電泳見圖3。36株CC103無乳鏈球菌共檢出Ⅰa型和Ⅲ型兩種血清型，其中ST103和ST485均為血清學(xué)Ⅰa型，而ST651和ST862菌株均為血清學(xué)Ⅲ型。

注：M為DL1000標(biāo)志物；1為ATCC12403無乳鏈球菌(血清學(xué)Ⅲ型陽性對照)；2為A909無乳鏈球菌(血清學(xué)Ⅰa型陽性對照)；3、4、6為實驗菌株(血清學(xué)Ⅲ型)；5為實驗菌株(血清學(xué)Ⅰa型)。

2.6毒力基因檢測結(jié)果 5種主要毒力基因的電泳見圖4，bca、cfb、bac、scpB、lmb檢出率依次為100.00%(36/36)、100.00%(36/36)、30.60%(11/36)、25.00%(9/36)和27.80%(10/36)。

注：a為bca基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2和3為陽性標(biāo)本；b為cfa基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2為陽性標(biāo)本；c為bac基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2和3為陽性標(biāo)本；d為scpB基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2和3為陽性標(biāo)本；e為lmb基因，M為DL1000標(biāo)志物，1為陰性對照，2為陽性標(biāo)本。

3 討 論

有研究表明，定植無乳鏈球菌的表型和基因型均存地理區(qū)域性差異，且定植無乳鏈球菌可引起流產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)后宮內(nèi)感染和新生兒感染等不良妊娠結(jié)局[9-10]。因此，了解某地區(qū)的定植無乳鏈球菌的ST和血清型分布、耐藥性及所攜帶的耐藥基因、毒力因子等菌群特征，對該地區(qū)無乳鏈球菌引起不良妊娠結(jié)局的防控至關(guān)重要。據(jù)國外文獻(xiàn)報道，CC103菌株主要引起動物感染，以牛乳腺炎多見，人源性菌株較為少見[3]。然而，已有研究表明，人源性CC103定植菌株在我國的分離率呈上升趨勢[1,2,4]，但這些報道并未對CC103菌株的耐藥性和分子流行病學(xué)特征進(jìn)行系統(tǒng)性研究。本研究是首次對廣州地區(qū)的人源性CC103菌株進(jìn)行全面的分子流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性分析。

利用MLST對某地區(qū)的定植無乳鏈球菌進(jìn)行分型，可了解其系統(tǒng)發(fā)育譜系特征。本研究共檢出19種ST，來源于7個CC，這表明廣州地區(qū)的定植無乳鏈球菌具有較高的遺傳多態(tài)性。雖然本研究ST種類相對較多，但仍以ST19(28.50%)和ST17(13.10%)為主，這和來自其他地區(qū)的報道[11-12]相似。本研究通過eBURST3.1軟件對所有ST進(jìn)行歸類分析，表明該地區(qū)CC103(26.30%)已成為僅次于CC19(42.30%)的主要定植菌株之一，CC103所占比例以及主要ST組成均與廣西地區(qū)的報道[4]相似。此外，有研究報道，收集了2017年分離于廣東省婦幼保健院的定植無乳鏈球菌72株，結(jié)果顯示CC103占23.50%，且主要ST分布也和本研究相似[1]。據(jù)此，本文推測CC103是華南地區(qū)流行的主要定植株之一，且其主要ST分布相似，但這需要更多的來自于華南地區(qū)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)才能支持該推測。研究表明，北京[12]和上海[7]地區(qū)的人源性CC103菌株以ST485或ST103為主，未發(fā)現(xiàn)ST651和ST862菌株，且CC103所占比例低于本研究和廣西地區(qū)的報道。這表明同一CC的ST分布可能會因地理區(qū)域不同而存在差異。

目前，對于無乳鏈球菌引起妊娠不良結(jié)局的產(chǎn)時抗菌藥物預(yù)防，指南多推薦采用青霉素作為首選藥物[13]。本研究中的定植菌株對青霉素均敏感，這證實青霉素可作為本地區(qū)產(chǎn)時抗菌藥物預(yù)防的經(jīng)驗性用藥選擇。對于青霉素過敏的孕婦而言，紅霉素和克林霉素是其產(chǎn)時抗菌藥物預(yù)防的重要替代藥物[1]。但國內(nèi)外的報道均表明無乳鏈球菌對兩者的耐藥率呈上升趨勢[14-15]。本研究中，定植菌株對紅霉素(67.20%)和克林霉素(47.40%)的耐藥率較高，這與北京[16]、烏魯木齊[17]、深圳[18]等國內(nèi)城市相似。因此，采用紅霉素或克林霉素進(jìn)行產(chǎn)時抗菌藥物預(yù)防，建議根據(jù)藥敏結(jié)果選擇藥物。本研究中，CC103菌株對于紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率以及多重耐藥率均低于非CC103菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，這表明不同CC的定植菌株耐藥性存在差異。本研究中，定植菌株的耐藥性差異還表現(xiàn)在同一CC的不同ST間，如ST103和ST485對于紅霉素、克林霉素和氯霉素均敏感，而ST651和ST862對3者耐藥率均>60.00%。此外，有研究表明廣州地區(qū)定植菌株對四環(huán)素的耐藥率較高(耐藥率>80.00%)[1,19]，但本研究的CC103菌株中僅ST485對四環(huán)素耐藥率(84.60%)較高，而其他3種ST的耐藥率均<10.00%，這也進(jìn)一步表明同一CC的不同ST的耐藥性的差異。無乳鏈球菌對紅霉素耐藥主要由ermB、mefA/E、ermTR基因介導(dǎo)，而linB基因主要是介導(dǎo)其對紅霉素中介和克林霉素耐藥[20]。耐藥基因檢測結(jié)果表明，ST651與ST862對紅霉素的耐藥機(jī)制不完全相同，前者對紅霉素的耐藥主要由ermB基因介導(dǎo)，而后者由ermB和mefA/E基因同時介導(dǎo)；ST651和ST862對克林霉素耐藥均與linB基因有關(guān)。

無乳鏈球菌的莢膜多糖是其重要的毒力因子[20]。因此，根據(jù)莢膜多糖的抗原性不同對無乳鏈球菌進(jìn)行血清學(xué)分型，對了解其致病性至關(guān)重要。此外，莢膜多糖還是疫苗設(shè)計的重要靶點(diǎn)[20]，了解某地區(qū)的無乳鏈球菌血清型分布，對開發(fā)適用于該地區(qū)的莢膜多糖疫苗有重要價值。分子血清學(xué)分型結(jié)果表明，本研究中人源性CC103菌株的ST有與其相對應(yīng)的特定血清型，如：ST103和ST485均為Ⅰa型，ST651和ST862菌株均為Ⅲ型，這與WANG[2]報道相似。無乳鏈球菌的致病性不僅取決于莢膜多糖，還與多種毒力因子相關(guān)[18]。本研究共檢測了參與編碼黏附、侵襲及免疫逃逸相關(guān)蛋白的5種主要毒力基因(bca、cfb、bac、scpB、lmb)，結(jié)果顯示，與侵襲力相關(guān)的毒力基因bca和cfa存在于所有CC103菌株中，而bac、scpB、lmb的檢出率均<33.00%。此外，特定ST的CC103菌株毒力基因譜相對固定，且不同ST毒力基因譜存在差異。換而言之，部分毒力基因分布因ST而異，如：參與宿主細(xì)胞黏附的毒力基因lmb主要分布于ST103和ST862；與免疫逃逸相關(guān)的毒力基因bac主要分布于ST651。

綜上所述，廣州地區(qū)的定植無乳鏈球菌具有較高的遺傳多態(tài)性，CC103菌株已成為該地區(qū)流行的主要的人源性CC之一。該地區(qū)人源性CC103菌株主要由ST103、ST485、ST651、ST862組成，其中ST651和ST862對紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，但對紅霉素耐藥的機(jī)制不同。此外，4種ST的血清型和毒力基因分布存在差異。總體上，本研究初步闡明了廣州地區(qū)人源性CC103無乳鏈球菌的主要ST分布、耐藥特點(diǎn)和分子流性特征。但相對于廣州地區(qū)的龐大人口基數(shù)而言，本研究收集的樣本量相對較少，若要深入了解該地區(qū)人源性CC103菌株的耐藥特點(diǎn)和分子流行特征，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。