韓 波，朱思綺，朱敬軒，張 程

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧沈陽(yáng) 116600

重癥肌無(wú)力(MG)是一種多因素調(diào)控的器官特異性自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)為全身或部分骨骼肌無(wú)力和易疲勞。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)提示MG發(fā)病率為(0.3～2.8)/100 000，全球約有70萬(wàn)MG患者，而中國(guó)年平均發(fā)病率為(8.0～20.0)/100 000。MG的女性患病率較男性高，且在各個(gè)年齡階段均可發(fā)病。目前，診斷MG在具有臨床特征的基礎(chǔ)上，尚缺乏快速高效的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷指標(biāo)，需要探尋更高靈敏度和(或)特異度的診斷方法，因此，本研究聯(lián)合檢測(cè)乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)和抗橫紋肌抗體(AsM-Ab)，評(píng)價(jià)這兩種血清自身抗體聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MG的診斷價(jià)值，為臨床提供診斷客觀依據(jù)，以便進(jìn)一步展開(kāi)治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2018年11月至2019年12月初步診斷為MG的患者150例為MG組，其中男55例、女95例，平均年齡(45.65±15.72)歲，眼肌型30例、全身型66例、重度激進(jìn)型28例、遲發(fā)重度型17例、肌萎縮型9例[1]；選擇同期在本院門(mén)診和住院的除患有MG之外的其他自身免疫病患者70例為其他自身免疫病組(OAD組)，其中男24例、女46例，平均年齡(41.37±12.66)歲；選取同期體檢健康者80例為健康對(duì)照組，其中男28例、女52例，平均年齡(42.16±11.44)歲。各組的年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.1.1MG的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2](1)臨床表現(xiàn)：某些特定的橫紋肌無(wú)力，晨輕暮重；(2)藥理學(xué)表現(xiàn)：新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性；(3)重復(fù)神經(jīng)刺激(RNS)檢查波幅遞減10.00%以上；(4)在多數(shù)全身型MG患者血中可檢測(cè)到AchR-Ab。在具備典型MG臨床特征的基礎(chǔ)上，同時(shí)具備藥理學(xué)特征和(或)神經(jīng)電生理學(xué)特征，臨床上則可診斷為MG。有條件的單位可檢測(cè)患者血中的AchR-Ab等有助于進(jìn)一步明確診斷。需要排除發(fā)病前3個(gè)月內(nèi)曾使用激素或免疫抑制劑者，伴有其他自身免疫性疾病、其他肌肉疾病或合并心、肺、肝、腎等器官功能疾病及妊娠或哺乳期婦女。

1.1.2MG的臨床分型 改良的Osserman分型[2]Ⅰ型：眼肌型；Ⅱ型：全身型，ⅡA型(輕度全身型),ⅡB型(中度全身型)；Ⅲ型：重度激進(jìn)型；Ⅳ型：遲發(fā)重度型；Ⅴ型：肌萎縮型。

1.2儀器與試劑 抗核抗體譜(IgG)的檢測(cè)采用IgG檢測(cè)試劑盒(印跡法)[來(lái)自歐蒙公司(批號(hào)為CD200721AA)]、IgG檢測(cè)試劑盒(間接免疫熒光法)[來(lái)自歐蒙公司(批號(hào)為CF200527AC)]、AchR-Ab酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒[來(lái)自英國(guó)RSR公司(批號(hào)為KAE88A)]、歐蒙熒光顯微鏡EUROStar、酶標(biāo)儀BIO-RAD(Model 680)。

1.3方法 所有研究對(duì)象均空腹采集當(dāng)日或入院后次日肘正中靜脈血3～5 mL經(jīng)3 000 r/min離心10 min后，取上清液，保存于-20 ℃冰箱待測(cè)。

1.3.1ELISA檢測(cè)AchR-Ab (1)分別取待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及校準(zhǔn)血清100 μL裝入1.5 mL的Eppendorf管中，并做好相應(yīng)標(biāo)記。(2)加入25 μL胎兒型和成人型AchR混合物并密封試管，確保所有液體都在試管底部(可15 000 r/min離心10 s)，振蕩混勻，于2～8 ℃孵育16～20 h。(3)將每管樣品AchR混合物振蕩混勻后，分別取50 μL加入AchR MAb1酶標(biāo)板中，并留2個(gè)孔作為空白對(duì)照，在室溫下用ELISA平板搖床(500次/min)孵育1 h。(4)將液體吸出，稀釋液清洗酶標(biāo)板3次。(5)將50 μL重組AchR MAb生物素加入每孔中(除空白孔外)，置室溫下用ELISA平板搖床(500次/min)孵育1 h。(6)重復(fù)步驟(4)。(7)將100 μL抗生蛋白鏈霉素-過(guò)氧化物酶(SA-POD)加入每孔中(除空白孔外)，置室溫下用ELISA平板搖床(500次/min)孵育30 min。(8)重復(fù)步驟(4)，再用清水洗滌一次后。(9)將100 μL顯色物TMB加入每孔中(包括空白孔)，在室溫下黑暗中放置30 min。(10)將50 μL終止液加入每孔中，在搖板器上搖動(dòng)約5 s。(11)在30 min內(nèi)于450 nm波長(zhǎng)處讀取每個(gè)孔的吸光度，血清抗AchR抗體>0.45 nmol/L即為陽(yáng)性。

1.3.2間接熒光免疫(IFA)檢測(cè)AsM-Ab (1)滴加0.01 mol/L,pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)于已知抗原標(biāo)本片，10 min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。(2)用PBS緩沖液以1∶100,1∶1 000兩個(gè)稀釋倍數(shù)稀釋標(biāo)本。(3)滴加25 μL已稀釋的待檢抗體標(biāo)本，37 ℃保溫30 min。(4)用PBS沖洗1～2次，于PBS浸泡5 min。(5)用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加25 μL熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體，37 ℃保溫30 min。(6)重復(fù)操作4。(7)用濾紙吸去多余水分，滴加1滴緩沖甘油。(8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度：(-)無(wú)熒光；(±)極弱的可疑熒光；(+)熒光較弱，但清楚可見(jiàn)；(++)熒光明亮；(+++～++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽(yáng)性。(9)根據(jù)判定結(jié)果決定標(biāo)本最終的滴度。

陽(yáng)性結(jié)果(熒光模式)，猴髂腰?。汗趋兰〖?xì)胞胞質(zhì)可見(jiàn)典型的橫紋熒光見(jiàn)圖1。猴心?。盒募〖?xì)胞胞質(zhì)可見(jiàn)典型的橫紋熒光見(jiàn)圖2。

圖1 猴髂腰肌橫紋熒光圖

圖2 猴心肌橫紋熒光圖

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 上述數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS23.0軟件進(jìn)行，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表分別計(jì)算各自身抗體單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。3組抗體陽(yáng)性率比較及分析抗體與臨床表型的關(guān)系均采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AchR-Ab、AsM-Ab陽(yáng)性率的比較 MG組的AchR-Ab、AsM-Ab陽(yáng)性檢出率明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AchR-Ab、AsM-Ab陽(yáng)性率的比較[n(%)]

2.2單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)抗體對(duì)診斷MG的效能評(píng)價(jià) 單項(xiàng)指標(biāo)比較，AchR-Ab診斷MG的靈敏度高于AsM-Ab，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷MG的靈敏度高于單項(xiàng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合檢測(cè)的特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均高于任意一項(xiàng)單項(xiàng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)抗體對(duì)診斷MG的效能評(píng)價(jià)(%)

2.3AsM-Ab與改良Osserman分型的關(guān)系 MG組的AsM-Ab陽(yáng)性率Ⅰ型為16.70%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型依次高于Ⅰ型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 AsM-Ab與改良Osserman分型的關(guān)系

3 討 論

MG是一類高發(fā)病率的器官特異性自身免疫性疾病，嚴(yán)重影響患者的正常生活和身心健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。MG患者的臨床和病理表現(xiàn)多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且由于MG患者的個(gè)體化差異，比如病情嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡、體內(nèi)抗體狀態(tài)、并發(fā)癥和不良反應(yīng)等[3]，應(yīng)給予快速準(zhǔn)確的診斷。

MG 的發(fā)病機(jī)制到目前為止并不十分清楚，其主要病因是患者機(jī)體中出現(xiàn)針對(duì)神經(jīng)-肌肉接頭(NMJ)突觸后膜上成分的自身抗體所致，主要是AchR-Ab。AchR是由4種同源亞基構(gòu)成的跨膜糖蛋白，屬于陽(yáng)離子通道[4]。人類肌肉有2種類型的AchR，其中胎兒型的亞基組成為 2α、β、δ、γ，成人型中γ亞基被ε亞基所取代[5]。AchR-Ab的主要免疫原區(qū)(MIR)在α亞基，其核心部位位于胞外段的第67～76位氨基酸。AchR-Ab大多數(shù)為IgG1和IgG3亞型，通過(guò)與突觸后膜上的AchR結(jié)合，可以激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使突觸后膜受體數(shù)目減少[6]，阻斷骨骼肌間神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)。超過(guò)85.00%的全身型MG患者和大約一半的單純眼部肌無(wú)力患者都有AchR-Ab[7],且其陽(yáng)性為診斷MG標(biāo)準(zhǔn)之一，故AchR-Ab為診斷該病的必須檢測(cè)項(xiàng)目。

MG患者的外周血中除了AchR-Ab外，還存在多種以肌肉為靶點(diǎn)的抗體，稱為抗肌抗體。有研究表明[8]首先應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)MG患者血清內(nèi)存在一種與骨骼肌結(jié)合的球蛋白因子，有研究[9]表明此種球蛋白因子是IgG，熒光顯微鏡下它與骨骼肌結(jié)合的形式呈橫紋狀，稱之為AsM-Ab，有文獻(xiàn)報(bào)道其抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為47.00%，可應(yīng)用于MG的診斷[10]。有研究表明，間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)抗肌抗體有助于確診疑似MG患者，尤其是患者AchR-Ab陰性時(shí)，AsM-Ab的檢測(cè)尤為重要[11]。間接免疫熒光法是以純化的猴髂腰肌、心肌細(xì)胞作為檢測(cè)MG自身抗體的抗原基質(zhì)，再以熒光示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位。此方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快，與放射免疫(RIPA)相比，其無(wú)放射性污染且操作簡(jiǎn)單。與免疫印跡法相比，其包含所有骨骼肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞的全部細(xì)胞結(jié)構(gòu)，篩查范圍更廣，靈敏度更高。

本研究對(duì)150例MG患者、70例其他自身免疫病患者及80例健康對(duì)照者的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示AchR-Ab和AsM-Ab診斷MG的陽(yáng)性檢出率分別為80.67%和57.33%，均高于OAD組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AchR-Ab在MG患者中陽(yáng)性率高的原因[12]為：(1)補(bǔ)體激活造成AchR破壞和突觸后膜局灶性溶解，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭處終板膜上的AchR和AchR相關(guān)蛋白的破壞；(2)封閉乙酰膽堿受體導(dǎo)致其加速內(nèi)化和降解；(3)AchR 阻斷乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)。AsM-Ab在MG患者中陽(yáng)性率偏高的原因?yàn)?，在補(bǔ)體參與下，AsM-Ab與其受體發(fā)生應(yīng)答，經(jīng)由補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞膜溶解作用使骨骼肌成分被大量破壞，影響了神經(jīng)肌肉組織的信號(hào)傳導(dǎo)及肌纖維的收縮，導(dǎo)致肌無(wú)力[12]。說(shuō)明兩種血清自身抗體是診斷MG的標(biāo)志性抗體，也提示AsM-Ab檢測(cè)有助于MG和其他自身免疫病的鑒別，且具有較滿意的診斷價(jià)值，是診斷MG的新型免疫學(xué)指標(biāo)，可在臨床推廣應(yīng)用。其中，AchR-Ab的陽(yáng)性率高于張鵬等[12]的研究，可能與不同的實(shí)驗(yàn)方法其靈敏度和特異度不同有關(guān)；AsM-Ab的陽(yáng)性率高于朱慧等[9]的研究，可能與間接免疫熒光效價(jià)的判斷有關(guān)，目前仍采用人工鏡檢的方式判讀結(jié)果，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的判讀標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同。

本研究同時(shí)分析了AsM-Ab與改良Osserman分型之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MG患者Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型的AsM-Ab陽(yáng)性率依次高于Ⅰ型，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有學(xué)者研究認(rèn)為，AsM-Ab存在于高達(dá)95.00%的胸腺瘤MG患者和50.00%的晚發(fā)型無(wú)胸腺瘤MG患者[13]，可初步推測(cè)AsM-Ab可能預(yù)示病情的嚴(yán)重程度和(或)伴隨胸腺瘤的發(fā)生，尚待進(jìn)一步的前瞻性研究。

本研究同時(shí)對(duì)MG患者的AchR-Ab和AsM-Ab進(jìn)行單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AchR-Ab的靈敏度高于AsM-Ab，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于AsM-Ab的靈敏度(57.30%)較低，單獨(dú)檢測(cè)一種自身抗體診斷MG的靈敏度和準(zhǔn)確性存在局限性，需將兩種抗體聯(lián)合檢測(cè)，以提高診斷價(jià)值。本研究對(duì)AchR-Ab、AsM-Ab兩種血清自身抗體聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)時(shí)比任意一項(xiàng)陽(yáng)性時(shí)診斷MG的靈敏度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值也均較單項(xiàng)檢測(cè)有所提高，因此，聯(lián)合檢測(cè)可大幅度降低漏診率、減少誤診率，具有很高的診斷價(jià)值。

綜上所述，AchR-Ab和AsM-Ab是診斷MG的標(biāo)志性抗體，聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷MG的靈敏度，降低因單項(xiàng)檢測(cè)出現(xiàn)的漏診和誤診；同時(shí)AsM-Ab可作為判斷患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，為臨床進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)性治療提供重要依據(jù)。