包正宇

樊銘聰1,2

李 言1,2

錢海峰1,2

張 暉1,2

齊希光1,2

王 立1,2

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 食品科學(xué)與工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

人體餐后血糖的變化與消化酶體系中淀粉類消化酶的活性密切相關(guān)(如胰腺α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)，其活性越強(qiáng)可導(dǎo)致小腸內(nèi)的葡萄糖吸收量增加[1]。以此為作用靶點(diǎn)利用酶抑制劑降低酶活，則可有效降低餐后高血糖的發(fā)生。目前天然來源的消化酶抑制劑成為研究的主流，而從日常食用的果蔬、谷物等植物性食物以及中草藥中尋找天然的淀粉類消化酶抑制劑成為研究的熱點(diǎn)[2]。烏飯樹是一種歷史悠久的藥用植物資源，其樹葉含有豐富的活性成分，具有多種藥用功效及良好的染色性能[3]。中國民間傳統(tǒng)谷物食品——烏米飯便是以烏飯樹樹葉為原料染制，藍(lán)黑色素賦予了烏米飯亮麗的色澤和清香的風(fēng)味，更使其營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)超其大米原料。中醫(yī)認(rèn)為烏米飯具有補(bǔ)益脾腎、安神明目、止咳烏發(fā)的功效[4]，經(jīng)研究團(tuán)隊(duì)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，常食烏米飯可改善2型糖尿病患者血糖水平。與普通大米相比，烏米飯中的藍(lán)黑色素是其潛在的活性物質(zhì)。

結(jié)合國內(nèi)外烏飯樹樹葉色素的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段的研究一直存在誤區(qū)：將粗提物中的類黃酮作為色素量化指標(biāo)來衡量色素的優(yōu)劣。這類物質(zhì)在氧化后轉(zhuǎn)化成黑色的醌類化合物，所得色素則是醌類和黃酮化合物的混合物，而制備的色素粗提物與實(shí)際烏米表面的藍(lán)黑色并不相符，因此該評價(jià)方法并不準(zhǔn)確[5]。Fan等[6]通過對比染色體系中活性成分的變化情況發(fā)現(xiàn)形成藍(lán)黑色素的前體物質(zhì)為環(huán)烯醚萜苷類化合物，并進(jìn)一步確證其呈色條件。該化合物經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后釋放苷元，苷元在酸性條件下可與伯胺基親核側(cè)鏈(R—NH2)共價(jià)結(jié)合形成有色絡(luò)合物[7]，以該類有色絡(luò)合物為底物繼續(xù)聚合，可形成含有大量發(fā)色團(tuán)的復(fù)雜混合物，即烏米飯染色后所呈現(xiàn)的藍(lán)黑色物質(zhì)[8]?；谏鲜錾爻噬珯C(jī)理，Lian等[9]進(jìn)一步優(yōu)化了色素反應(yīng)條件，并提出了藍(lán)黑色素的制備方法，與傳統(tǒng)烏米飯制備方法相比克服了染色工藝可控性差的缺點(diǎn)。此外，F(xiàn)an等[10]還證實(shí)了利用該方法制備的藍(lán)黑色素對豬胰α-淀粉酶具有較好的抑制性，其IC50值為2.92 mg/mL，但尚未對該色素的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究。試驗(yàn)擬針對烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行探究，以期為烏飯樹藍(lán)黑色素的調(diào)節(jié)血糖功能提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

烏飯樹樹葉：產(chǎn)地江蘇省溧陽市；

α-葡萄糖苷酶：酶活25.4 U/mg，上海源葉生物技術(shù)有限公司；

β-葡萄糖苷酶：酶活20～40 U/mg，上海源葉生物技術(shù)有限公司；

葡聚糖凝膠：G-25型，上海源葉生物技術(shù)有限公司；

對硝基苯酚、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷:純度>98%,美國Sigma公司；

甘氨酸、無水乙醇、PBS緩沖鹽溶液：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-100型，瑞士Buchi公司；

離心機(jī)：CR21GIII型，日本日立公司；

冷凍干燥機(jī)：FreeZone-6型，美國Labcone公司；

紫外分光光度計(jì)：T-9型，北京普析通用儀器有限公司；

熒光光譜儀：F-7000型，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素的制備 參照文獻(xiàn)[9]。

1.3.2 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-G)水解法測定α-葡萄糖苷酶活性[11]22-23。pNP-G經(jīng)水解后生成對硝基苯酚，在405 nm處可檢測其最大吸收值，由此可計(jì)算α-葡萄糖苷酶的催化速率及活性。配制對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度依次為2，6，10，14，18 μg/mL，于405 nm處檢測，根據(jù)結(jié)果計(jì)算回歸曲線，得到回歸方程：Y=21.35X+0.028，其中R2=0.995。

1.3.3 藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 參照王曉婷[11]22的方法。利用0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH 6.9)配制α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)和pNP-G溶液(1.0 mmol/L)，分別取α-葡萄糖苷酶溶液和色素溶液各1.0 mL混勻后37 ℃水浴10 min。在混合溶液中加入1.0 mL pNP-G溶液，37 ℃反應(yīng)20 min后，再加入1.0 mL無水乙醇以終止酶解反應(yīng)，定容至5.0 mL后利用405 nm處吸光值計(jì)算酶的活性。測定樣品分4組：樣品組、樣品空白組、對照組和空白組，每組3個平行。按式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

式中：

P——抑制率，%；

As——樣品組吸光度值；

Asb——樣品空白組吸光度值；

Ac——對照組吸光度值；

Ab——空白組吸光度值。

1.3.4 藍(lán)黑色素抑制動力學(xué)研究 分別配制不同濃度的對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L)，每個底物濃度溶液中分別加入1.0 mLα-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)和1.0 mL不同濃度的色素溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)速率由37 ℃條件下20 min內(nèi)pNP生成量計(jì)算。測得反應(yīng)速率后以底物pNP-G濃度([S])與反應(yīng)速率(V)作Linewaver-Burk雙倒數(shù)曲線方程，計(jì)算公式：

(2)

式中：

v——初始反應(yīng)速率，μg/min；

Vmax——最大初始反應(yīng)速率，μg/min；

[S]——pNP-G濃度，mmol/L；

Km——米氏常數(shù)。

混合抑制型和競爭抑制型的Dixon方程：

(3)

(4)

式中：

i——色素質(zhì)量濃度，mg/mL；

a——pNP-G濃度，mmol/L；

Kic——競爭性抑制常數(shù)；

Kiu——非競爭性抑制常數(shù)。

Dixon曲線不能直接推導(dǎo)出Kiu，但通過變化不同底物濃度參數(shù)可推導(dǎo)Cornish-Bowden方程，即v/a和i之間的關(guān)系。非競爭性抑制或混合抑制可通過該方程反映：

(5)

將式(5)兩側(cè)取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為a/v與i之間的線性回歸方程，不同pNP-G濃度下各Cornish-Bowden曲線相交的橫軸截距即為Kiu。

1.3.5 藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶熒光特性的影響 采用日立熒光光譜儀進(jìn)行α-葡萄糖苷酶的熒光光譜測定，參照Fan等[10]的方法在300～400 nm范圍內(nèi)記錄光譜變化情況。

可用Stern-Volmer方程表示熒光淬滅：

(6)

式中：

F0、F——α-葡萄糖苷酶與色素相互作用前后的熒光強(qiáng)度；

[Q]——色素質(zhì)量濃度，mg/mL；

τ0——熒光物質(zhì)在無淬滅劑影響下的平均壽命，生物大分子的τ0值一般為10-8s；

Kq——淬滅速率常數(shù)；

KFQ——Stern-Volmer淬滅常數(shù)。

式(6)表征熒光動態(tài)淬滅時(shí)F0/F與[Q]的線性關(guān)系，而F0/F與[Q]呈指數(shù)關(guān)系時(shí)表示為靜態(tài)淬滅[12]。通過修正的Stern-Volmer方程式[式(7)]描述靜態(tài)猝滅。

(7)

可用式(8)描述混合體系中小分子與蛋白分子相互作用的平衡狀態(tài)[13]：

(8)

式中：

Ka——色素與α-葡萄糖苷酶之間的結(jié)合常數(shù)；

n——結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，樣品平均值之間的顯著性差異以P<0.05表示，使用Origin 2019繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖1可以看出，當(dāng)色素質(zhì)量濃度>0.1 mg/mL時(shí)，藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制作用(P<0.05)，抑制率隨著色素質(zhì)量濃度的增加而增加，其IC50為0.373 mg/mL。繼續(xù)增大色素質(zhì)量濃度，抑制效果增長速率變緩。眾多研究表明植物活性成分對糖苷消化酶具有較好的抑制活性，徐叢玥等[14]報(bào)道了綠茶提取物、葛根提取物、苦瓜提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50分別為0.42，3.63，19.63 mg/mL，李波等[15]發(fā)現(xiàn)紅松松球鱗片多酚提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為0.71 mg/mL，而阿卡波糖的IC50為0.62 mg/mL。而劉杰超等[16]發(fā)現(xiàn)蘋果多酚提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.72 mg/L，抑制率最高可達(dá)到96.62%。由此可知，烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素的α-葡萄糖苷酶抑制作用要優(yōu)于阿卡波糖及紅松松球鱗片多酚，較蘋果多酚則略有不足。目前，阿卡波糖被廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病及耐糖量降低時(shí)的餐后高血糖，但服用后會伴隨著腸胃脹氣、腹瀉、腹脹等副作用[17]。因此，作為天然植物色素，烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素對人體的安全性更高，其α-葡萄糖苷酶抑制活性可在調(diào)節(jié)血糖方面具有良好的應(yīng)用前景。

2.2 藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)分析

根據(jù)酶活速率的雙倒數(shù)曲線，可推算出酶反應(yīng)體系的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax，比較曲線變化后可判斷色素抑制類型。圖2、圖3分別為α-葡萄糖苷酶的Dixon和Cornish-Bowden曲線。由圖2可知，Dixon曲線中不同pNP-G濃度的擬合曲線在第二象限無交點(diǎn)。而在Cornish-Bowden曲線中(圖3)，各擬合曲線相交于第二象限，可推算出非競爭抑制常數(shù)Kiu=0.338(表1)。反應(yīng)體系中不同pNP-G濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L，擬合常數(shù)R2分別為0.963，0.993，0.987，0.987，0.998。保持α-葡萄糖苷酶濃度不變，在添加和不添加色素的條件下，改變底物pNP-G濃度(0.2～1.0 mmol/L)，測定酶反應(yīng)速率，經(jīng)回歸分析得到α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線。對于競爭性可逆抑制，抑制劑濃度變化不會影響Vmax值，Vmax值恒定，而對于非競爭性可逆抑制，抑制劑濃度的增加對Km值無影響，Km值恒定。根據(jù)圖4中的各曲線方程計(jì)算，有色素存在時(shí)，米氏常數(shù)Km值為2.88 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為0.5 μg/min，無色素存在時(shí)，Km值為1.58 mmol/L，Vmax為1.5 μg/min。當(dāng)色素濃度增大時(shí)，α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)Km逐漸降低、Vmax逐漸增大，說明烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素與上述兩種典型的抑制類型不同。由圖4可知，不同色素濃度條件下的Linewaver-Burk曲線方程在第二象限有交點(diǎn)，符合競爭性與非競爭性混合的雙倒數(shù)曲線圖像[18]，因此色素對α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于競爭性與非競爭性相混合的抑制類型。

圖1 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素的α-GI活性

在眾多植物提取物中，大部分植物提取物的α-葡萄糖苷酶抑制類型均屬于非競爭性抑制，如：蘋果多酚提取物、紅松松球多酚提取物、茶花粉黃酮提取物、大豆異黃酮提取物等[15-16,19-20]，少部分屬于競爭性抑制，如葛根素提取物[21]、梔子黃等[22]，也有一些屬于混合型可逆抑制類型，如楊梅[23]、紅旱蓮[24]中的類黃酮提取物，這取決于其中主要活性成分的結(jié)構(gòu)差異。研究人員[25]還發(fā)現(xiàn)，黑莓、樹莓等越橘屬植物提取物均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，推測其主要成分為單寧類和花色苷類。最新研究[7]發(fā)現(xiàn)，除多酚類化合物以外，烏飯樹樹葉中還含有較多的環(huán)烯醚萜苷類化合物，該類化合物是形成藍(lán)黑色素的主要前體物質(zhì)。陳靜文等[26]研究發(fā)現(xiàn)多種環(huán)烯醚萜苷類化合物均具有良好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，這是烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，但其中是何種化合物發(fā)揮抑制作用還需進(jìn)一步篩選分析。

圖2 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素α-GI的Dixon曲線

圖3 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素α-GI的Cornish-Bowden曲線

2.3 藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶熒光特性的影響

熒光光譜分析被廣泛用來表征熒光發(fā)色團(tuán)分子與淬滅分子之間的相互作用情況。圖5顯示了不同濃度藍(lán)黑色素與α-葡萄糖苷酶混合溶液在300～400 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜變化情況。由圖5可知，α-葡萄糖苷酶分子的熒光強(qiáng)度峰值位于339.2 nm，其熒光強(qiáng)度隨色素濃度的增加而逐漸降低(P<0.05)，色素的加入使α-葡萄糖苷酶的熒光光譜峰發(fā)生紅移現(xiàn)象，說明藍(lán)黑色素分子與α-葡萄糖苷酶發(fā)生了相互作用[27]。

表1 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素的α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)常數(shù)

圖4 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素α-GI的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

表2顯示了α-葡萄糖苷酶熒光強(qiáng)度比對色素濃度的關(guān)系，圖6顯示了α-葡萄糖苷酶熒光淬滅的Stern-Volmer曲線，曲線呈正指數(shù)增長(P<0.05)，曲線方程為y=1.49e1.50[Q]，R2為0.996，說明色素與α-葡萄糖苷酶的相互作用模式屬于靜態(tài)淬滅類型。因此，選取修正的Stern-Volmer曲線描述熒光淬滅現(xiàn)象，經(jīng)分析得到Stern-Volmer修正方程的擬合曲線斜率為1.504 mg/mL，基于質(zhì)譜分析推測出的色素分子量[9]，計(jì)算出其KFQ值為648 L/mol?？捎缮锎蠓肿应?(10-8s)推算出Kq為6.48×1010L/(mol·s)。常數(shù)Kq可以反映熒光淬滅的效率或熒光基團(tuán)對淬滅劑的可結(jié)合水平，其Kq值大于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞淬滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)[13]，表明藍(lán)黑色素對酶的熒光淬滅作用是由于色素與酶分子間形成基態(tài)復(fù)合物引起的靜態(tài)淬滅現(xiàn)象。

圖5 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素作用α-葡萄糖苷酶后的熒光曲線

根據(jù)式(8)，lg[ (F0-F)/F]和lg [Q]呈線性相關(guān)性，R2=0.919，該擬合曲線斜率表示結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)，而曲線的截距可計(jì)算出結(jié)合常數(shù)(Ka)，得到Ka為2.5×104L/mol，結(jié)合位點(diǎn)為0.991，約等于1。由此可知，烏飯樹樹葉色素對α-葡萄糖苷酶具有較好的結(jié)合作用，存在一個結(jié)合位點(diǎn)。但是，該色素對于不同來源酶的作用效果并不相同。研究團(tuán)隊(duì)前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素與α-淀粉酶的理論結(jié)合位點(diǎn)存在兩個，其抑制作用并沒有表現(xiàn)出極強(qiáng)的效果，IC50為2.92 mg/mL，而阿卡波糖抑制α-淀粉酶的IC50為0.87 mg/mL，可能是因?yàn)樯嘏cα-淀粉酶的理論結(jié)合位點(diǎn)較多，導(dǎo)致其抑制效率降低，其中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

表2 烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶的熒光參數(shù)?

圖6 α-葡萄糖苷酶熒光淬滅的Stern-Volmer曲線

3 結(jié)論

烏飯樹樹葉藍(lán)黑色素表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性作用，IC50值為0.373 mg/mL。通過抑制動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)藍(lán)黑色素對α-葡萄糖苷酶呈競爭性與非競爭性的混合型抑制關(guān)系。熒光光譜分析可知色素對α-葡萄糖苷酶熒光基團(tuán)的淬滅模式主要以靜態(tài)淬滅為主，酶分子熒光光譜峰值發(fā)生紅移，表明色素可破壞α-葡萄糖苷酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，使正常構(gòu)象解折疊導(dǎo)致酶分子失活。后續(xù)將繼續(xù)探討藍(lán)黑色素在加工過程中的變化規(guī)律及其在其他消化酶體系中的潛在作用。