唐文文

夏俊麗1

陳 垣2

(1. 銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物，因表皮呈鐵綠色而得名，在中國享有“救命仙草”“藥中黃金”之美譽(yù)，是一種藥食兩用中藥材，其功能性成分主要包括多糖類、生物堿類、黃酮類以及酚酸類等[1-3]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長、降低血糖、抗衰老等藥理活性[4]。鐵皮石斛生長緩慢、藥材資源珍貴，《中國藥典》規(guī)定其藥用部位為莖[5]，花和葉為非藥用部位。有研究[6]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉對(duì)“三高”癥狀有一定的輔助療效，石斛花有舒緩精神緊張、保持頭腦清醒、解除精神抑郁等功效。

目前，有關(guān)鐵皮石斛的研究大多集中在莖部或者某一類化學(xué)成分上，鮑素華等[7-9]研究了鐵皮石斛中多糖的抗氧化活性，黃琴等[10]研究了鐵皮石斛多酚、黃酮含量及抗氧化活性。而有關(guān)鐵皮石斛莖、葉、花的多指標(biāo)成分和抗氧化活性的綜合分析尚未見報(bào)道，且其中多糖類、黃酮類、多酚類以及生物堿類對(duì)鐵皮石斛抗氧化活性的關(guān)聯(lián)程度尚不明確。研究擬對(duì)鐵皮石斛莖、葉、花的多指標(biāo)功能性成分進(jìn)行差異性分析，采用DPPH自由基、ABTS自由基清除率和FRAP法對(duì)莖、葉、花抗氧化活性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，并通過相關(guān)性分析探討鐵皮石斛莖、葉、花抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)成分，確定其莖、葉、花的化學(xué)成分及其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為鐵皮石斛資源最大化、多樣化開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

鐵皮石斛：3年生，采于貴州松桃縣長興堡鎮(zhèn)，花采收于2020年5—6月，莖、葉采收于2020年10月底，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授和銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院梁玉勇教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-1801型，北京瑞麗分析儀器有限公司；

電子天平：CP214型，奧豪斯儀器有限公司；

超純水儀：New Human Power型，韓國Human公司；

阿魏酸：批號(hào)110773-201915，純度99.4%，中國食品藥品檢定研究院；

石斛堿：批號(hào)111876-201704，純度100%，中國食品藥品檢定研究院；

蘆?。号?hào)B20771，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

DPPH、ABTS、福林酚試劑：BR級(jí)，美國Sigma公司；

甲醇、乙醇、無水葡萄糖、苯酚、硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯仿、溴甲酚綠：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將鐵皮石斛花、莖、葉分揀，去雜，各鮮品于50 ℃ 烘干，備用。

1.2.2 多糖含量測(cè)定 參照《中國藥典》，線性回歸方程為Y=0.08X+0.002 1，R2=0.999 7。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 參照李志強(qiáng)等[11]的方法，線性回歸方程為Y=10.535X-0.001 3，R2=0.999 9。

1.2.4 總多酚含量測(cè)定 參照李娟等[12]的方法，線性回歸方程為Y=0.082 3X+0.007，R2=0.999 2。

1.2.5 總生物堿含量測(cè)定 參照李志強(qiáng)等[11]的方法，線性回歸方程為Y=0.123 7X-0.000 8，R2=0.999 2。

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定

(1) 樣品制備：分別取干燥后的鐵皮石斛莖、葉、花粉末(過三號(hào)篩) 約2.0 g，加入蒸餾水50 mL，加熱回流2 h，放冷，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容得水提物。以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇代替蒸餾水進(jìn)行提取，得醇提物。

Y=[A0-(AS-AS0)]/A0×100%，

(1)

式中：

Y——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度值；

As——樣品吸光度值；

AS0——樣品對(duì)照組吸光度值。

(3) ABTS自由基清除能力測(cè)定：將5 mL 7.0 mmol/L的ABTS溶液和5 mL 2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻，室溫避光靜置12 h，使用前，用乙醇稀釋至734 nm下的吸光度為0.70±0.02的ABTS+自由基工作液，取不同濃度的樣品溶液50 μL，加入2 mL ABTS+自由基工作液，混勻，室溫避光反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處吸光度，以維生素C為陽性對(duì)照，按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

膽堿（Choline）廣泛存在于植物界及人和動(dòng)物體液內(nèi)，是生物體代謝的中間產(chǎn)物。富含膽堿的食物有蛋類、動(dòng)物的腦、動(dòng)物心臟與肝臟、綠葉蔬菜、啤酒酵母、麥芽、大豆卵磷脂等。膽堿屬B族維生素，是目前世界公認(rèn)的14種維生素品種之一。膽堿現(xiàn)以化學(xué)法合成。

T=(1-AS/A0)×100%，

(2)

式中：

T——ABTS自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度值；

As——樣品吸光度值。

(4) FRAP總還原力測(cè)定：參照J(rèn)in等[14]的方法，以不同濃度的維生素C系列溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.005 5x+0.002 3，R2=0.999 3)，以維生素C當(dāng)量表示各樣品的抗氧化能力。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用OriginPro 9軟件計(jì)算IC50值，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要化學(xué)成分含量比較

由表1可知，鐵皮石斛莖、葉、花中多糖、總黃酮、總多酚和總生物堿含量差異顯著(P<0.05)，其中莖中多糖含量最高，為31.00%，葉中次之(15.04%)，僅為莖中的1/2，與陳靜等[15]的結(jié)果一致；花中多糖含量最低(8.11%)，可能是由于莖能夠特異性表達(dá)與甘露糖和果糖合成有關(guān)的一些關(guān)鍵酶基因，莖也因其富含多糖而被廣泛認(rèn)可，作為鐵皮石斛記入藥典的藥效部位。莖、葉、花中總黃酮和總多酚含量差異極顯著(P<0.01)，均以花中最高，分別為2.133%和15.71%，葉中次之，與黃彪等[16-17]的結(jié)果一致；黃酮類化合物也是一類非常重要的多酚化合物，鐵皮石斛莖、葉、花中總多酚含量遠(yuǎn)高于總黃酮，推測(cè)其應(yīng)含有酚酸類、單寧類以及花色苷類等多酚類物質(zhì)，特別是鐵皮石斛花中多酚類含量遠(yuǎn)高于莖，這與花中含量較多的花色素類成分有關(guān)，而多酚類物質(zhì)被稱為“第七類營養(yǎng)元素”，是具有促進(jìn)健康作用的一類化合物。生物堿類是鐵皮石斛中重要的化學(xué)成分之一，為鐵皮石斛的次生代謝產(chǎn)物，總生物堿含量以鐵皮石斛花中最高，達(dá)0.022 3%，為莖中的近4倍，這可能與花、葉中含有較多的阿魏酸、咖啡酸和對(duì)羥基苯甲酸等有機(jī)酸[16]，在提取過程中能與生物堿結(jié)合形成鹽，利于生物堿溶出有關(guān)，也可能是花中存在生物堿合成的特殊途徑，其具體途徑有待進(jìn)一步探索。

2.2 抗氧化活性比較

2.2.1 DPPH自由基清除作用 由圖1可知，鐵皮石斛莖、葉、花均有較高的DPPH自由基清除能力，且清除率隨樣品質(zhì)量濃度的升高而增大，其中花的水提物和醇提物對(duì)DPPH自由基的清除能力最大，當(dāng)質(zhì)量濃度為3 000 μg/mL時(shí)，其清除率分別達(dá)95.2%和91.3%，接近于維生素C的，可能與鐵皮石斛花中含有較多的花色素有關(guān)；各部位水提物的DPPH自由基清除能力為莖>葉，而醇提物的DPPH自由基清除能力為莖<葉；當(dāng)質(zhì)量濃度為3 000 μg/mL時(shí)，莖的水提物和醇提物的DPPH自由基清除能力相似，而葉的醇提物的DPPH自由基清除能力(86.2%)遠(yuǎn)優(yōu)于水提物(76.2%)的，這可能與鐵皮石斛葉中含有較多的黃酮類化合物和游離的多酚有關(guān)，黃酮類成分能夠直接捕捉自由基，而多酚的酚羥基是一種氫供體，具有很強(qiáng)的抗氧化效果[18-19]。

2.2.2 ABTS自由基清除作用 由圖2可知，鐵皮石斛莖、葉、花的ABTS自由基清除能力與DPPH自由基清除能力相似，各部位水提物對(duì)ABTS自由基的清除能力為花>莖>葉，醇提物為花>葉>莖，高濃度時(shí)，花的清除能力隨樣品質(zhì)量濃度的增加變化較大，說明到達(dá)一定質(zhì)量濃度時(shí)，鐵皮石斛花具有極強(qiáng)的抗氧化活性；當(dāng)質(zhì)量濃度為4 000 μg/mL時(shí)，莖、葉和花的醇提物的ABTS自由基清除能力遠(yuǎn)強(qiáng)于水提物的，說明莖、葉、花中起到ABTS自由基清除作用的成分主要是黃酮和多酚類物質(zhì)。

由表2可知，鐵皮石斛花水提物和醇提物清除DPPH自由基的IC50顯著強(qiáng)于莖和葉的(P<0.01)，但相對(duì)于莖醇提物來說，葉醇提物也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力(P<0.01)，此外各部位醇提物清除DPPH自由基的IC50值均顯著小于水提物的(P<0.01)，說明醇提物比水提物的抗氧化效果好。鐵皮石斛莖、葉、花水提物和醇提物清除ABTS自由基的IC50值均大于清除DPPH自由基的，說明各部位具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，此外，莖、葉醇提物清除ABTS自由基的IC50值未達(dá)到極顯著水平。

表1 鐵皮石斛莖、葉、花中各化學(xué)成分含量?

圖1 鐵皮石斛莖、葉、花的DPPH自由基清除能力

圖2 鐵皮石斛莖、葉、花的ABTS自由基清除能力

表2 鐵皮石斛莖、葉、花水提物和醇提物清除DPPH自由基和ABTS自由基的IC50?

2.2.3 鐵離子(FRAP)總還原力 由表3可知，F(xiàn)RAP總還原力與DPPH自由基和ABTS自由基的清除結(jié)果類似，花的水提物和醇提物的還原力最高，分別為125.60，36.49 mg維生素C/g樣品，葉的醇提物的還原力為10.78 mg維生素C/g樣品，與莖的差異顯著(P<0.05)。

綜上，鐵皮石斛花、葉均具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化活性，且其醇提物的抗氧化活性均優(yōu)于其傳統(tǒng)藥用部位——莖，可能與其黃酮和多酚含量較高有關(guān)。此外，鐵皮石斛莖、葉、花對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除力與FRAP抗氧化能力存在差異，這與其化學(xué)成分含量和組成不同有關(guān)，同時(shí)也與不同的抗氧化考察方法有關(guān)。不同的抗氧化體系中，莖、葉、花的抗氧化活性均低于維生素C的，可能是莖、葉、花粗提取液中的抗氧化活性物質(zhì)含量不夠高。

2.3 化學(xué)成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性

由表4可知，鐵皮石斛莖、葉、花抗氧化活性與總黃酮、總多酚和總生物堿含量呈正相關(guān)，其中DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP總還原力與總黃酮和總多酚含量極顯著相關(guān)(P<0.01)，與總生物堿含量顯著相關(guān)(P<0.05)，與鐵皮石斛莖、葉、花中總黃酮、總多酚和生物堿含量呈現(xiàn)一致性。此外，有研究[20]發(fā)現(xiàn)抗氧化活性主要與酚酸和黃酮含量密切相關(guān)；DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率與多糖含量無明顯相關(guān)性，F(xiàn)RAP抗氧化能力與多糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，黃凱偉等[21]的研究表明鐵皮石斛中堿溶性多糖的抗氧化活性優(yōu)于水溶性多糖的，推測(cè)多糖含量與抗氧化活性無相關(guān)性的原因是由于鐵皮石斛莖、葉、花水提物中的水溶性多糖抗氧化活性差造成的。

表3 鐵皮石斛莖、葉、花水提物和醇提物的 FRAP總還原力?

表4 鐵皮石斛莖、葉、花化學(xué)成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析?

3 結(jié)論

通過對(duì)比分析鐵皮石斛莖、葉、花中主要功能性成分多糖、黃酮、多酚和生物堿類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛莖、葉、花中均含有多糖、黃酮、多酚和生物堿類活性成分，且含量差異極顯著(P<0.01)；莖中多糖含量高于葉和花中的，但葉和花中黃酮類成分、多酚類成分以及生物堿類含量甚至比莖中更高，但試驗(yàn)測(cè)出的莖中總生物堿含量相對(duì)于諸燕等[22-23]的研究得出的結(jié)論較低，可能是樣品差異和分析方法不一致造成，后續(xù)將繼續(xù)探索。鐵皮石斛莖、葉、花的水提物和醇提物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力和FRAP總還原力均較強(qiáng)，其中花的抗氧化活性最強(qiáng)，葉的醇提物的抗氧化活性優(yōu)于莖的。鐵皮石斛莖、葉、花中的黃酮類成分和多酚類成分是其抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)成分。莖中含有較多的多糖類，葉和花中含有較多的黃酮類和多酚類，可以根據(jù)不同需要充分開發(fā)鐵皮石斛資源，葉和花一方面可以作為提取天然抗氧化劑的原料應(yīng)用于美容護(hù)膚產(chǎn)品、保健品和食品中，也可以制作養(yǎng)生茶、食品防腐劑、保健品添加劑等。鐵皮石斛葉相對(duì)于莖具有生長快、再生能力強(qiáng)、生物產(chǎn)量大的特點(diǎn)，具有更為廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價(jià)值，后續(xù)需對(duì)其葉和花的抗菌、抗疲勞等藥理活性和長期毒理試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。