高豪，陸家聲，章文明，2，董維亮，2，方艷，2，余子夷，信豐學，2，姜岷，2

（1 南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京 211816；2 南京工業(yè)大學，江蘇先進生物與化學制造協(xié)同創(chuàng)新中心（SICAM），江蘇南京 211816；3 南京工業(yè)大學化工學院，江蘇南京 211816）

固定化細胞是指固定在水不溶性載體上且能在一定的空間范圍進行生命活動的細胞?，F(xiàn)代固定化細胞技術是在固定化酶技術的推動下發(fā)展起來的[1]。該技術被定義為把游離細胞通過化學或物理手段固定在限域空間內，以減少外界不良環(huán)境對生物體的影響[2]，使其盡可能保持旺盛的代謝活性，且能被重復和連續(xù)使用的一種新興生物技術。細胞固定化技術在生物技術領域已經(jīng)顯示出巨大的應用潛力。比如，固定化細胞生物反應器因可以緩解高濃度底物和產物對細胞產生的抑制作用，已經(jīng)在生物發(fā)酵領域中得到了廣泛的應用[3-4]。

為了提高固定化細胞在生物發(fā)酵領域中的應用，本文分析了生物發(fā)酵中應用的各種固定化材料，特別是膜材料（中空纖維膜和微米/納米纖維膜）的最新進展，并對材料介導細胞固定化技術在微生物多細胞培養(yǎng)體系中的應用前景進行了展望。

1 固定化材料

根據(jù)其化學組成不同，固定化材料可分為高分子載體材料、無機載體材料和復合載體材料3類。其中，高分子材料中的膜材料有良好的力學性能和易于調節(jié)的特性，在細胞固定方面已經(jīng)引起了國內外研究人員的廣泛關注[5]。在利用膜材料作為固定化材料時不僅需要考慮到其力學性能和穩(wěn)定性等特點，也要考慮到材料表面粗糙度、親水性以及是否具有良好的生物相容性等。通過調節(jié)固定化載體材料的表面化學性質已被證明可以提高固定化細胞的活性和穩(wěn)定性。比如，多糖物質是一種具有特異生物學功能的多羥基碳水化合物，將糖基固定于高分子聚合物膜表面，不僅可提高膜表面的生物相容性，而且能賦予其更多特殊的生物學功能（見圖1）。

1.1 高分子載體材料在生物發(fā)酵領域的應用

1.1.1 天然有機高分子載體材料

圖1 膜表面糖基化處理用于浸入式固定化發(fā)酵

表1 利用天然高分子材料固定細胞進行生物發(fā)酵

天然有機高分子材料主要包括來源于生物體內（膠原蛋白、纖維蛋白、透明質酸）或生物體外的物質（殼聚糖、海藻酸鹽）（見表1）。它們具有一般對生物無毒、傳質性能較好和具有良好的生物相容性等優(yōu)點。常見的天然有機高分子載體材料有海藻酸鈉、果膠和殼聚糖等，已被廣泛應用于生物發(fā)酵系統(tǒng)中。例如，海藻酸鈉可應用于固定由熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum） 和熱解糖梭菌（C.thermolacticum）組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，提高了以木質纖維素為底物生物乙醇的發(fā)酵性能[6]。與游離細胞發(fā)酵相比，固定化細胞發(fā)酵生產乙醇的產量提高了60%以上[6]。當以木質纖維素水解液為底物時，堿預處理過程中產生的有毒物質和高pH會對細胞生長和代謝產生抑制作用，導致乙醇產量和收率降低[6]。海藻酸鈉固定化可通過物理包埋細胞形成微球，微球核心中可包埋C. thermocellum和C.thermolacticum。這種通過空間隔離的方式可使細胞免受發(fā)酵體系中有毒物質的毒害，同時可提高細胞對pH 變化的適應能力[6]。 干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）可利用果膠酸鈣為固定化載體生產乳酸，實現(xiàn)了乳糖的高轉化率（94.37%），且在16 批乳糖轉化為乳酸的發(fā)酵過程中保持穩(wěn)定[7]。當糞腸球菌（Enterococcus faecalis）以殼聚糖為固定化載體時，實現(xiàn)了以L-精氨酸為底物大規(guī)模生產L-瓜氨酸。其中，在工業(yè)生產規(guī)模上，1000kg的L-精氨酸可轉化為974.6kg的L-瓜氨酸[8]。同時，固定化細胞也可有效緩解攪拌器對細胞膜的損傷，細胞的力學性能可得到顯著改善。如在利用固定化細胞轉化L-精氨酸合成L-瓜氨酸過程中，經(jīng)過5 批發(fā)酵后產物收率仍高達98.9%，而游離細胞在第二批的收率僅有68.2%[8]。

天然有機高分子載體材料在固定細胞過程中也存在一些缺點，如機械強度較低、彈性差、在厭氧條件下易被微生物分解等。海藻酸鈉是由兩個重復羧基化單糖單元組成的多糖主鏈，其結構中含有羧基和羥基[9]。然而，由于現(xiàn)有的羧基和羥基在發(fā)酵過程中可以結合過量的水，這會顯著降低其機械強度。固定化顆粒的軟化和分解會影響細胞固定化的效率，導致生物發(fā)酵性能降低。在不影響生物相容性的情況下，通過化學改性引入更強的聚合物主鏈等方法可提高固定化材料的機械強度。如Zhang等[10]為了解決天然聚合物材料機械強度較低的問題，在海藻酸中加入適量的殼聚糖或Al2O3制備了新的細胞固定化載體，避免了海藻酸凝膠的分解、軟化和漂浮問題。吳亞杰等[11]在海藻酸凝膠球中添加無機材料粉末活性炭、SiO2、CaCO3和人造沸石，改善海藻酸凝膠球的機械強度。其中添加粉末活性炭能提高凝膠球的壓縮強度；添加SiO2能提高凝膠球的密度；添加CaCO3能提高凝膠球的傳質性能；添加人造沸石能提高凝膠球的抗拉強度。

1.1.2 人工合成有機高分子載體材料

人工合成有機高分子載體材料是人工合成的具有長鏈結構的有機材料，常見的有聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚氨基酸和聚乙烯醇等（見表2）。它們的特點是抗微生物分解性好、機械強度高和穩(wěn)定性強等。其中，聚酰胺基質的多孔珠狀材料可用于丙酸桿菌（Propionibacteriumsp.）的固定化，并提高了以葡萄糖為底物生產丙酸的發(fā)酵性能[14]。與游離細胞發(fā)酵相比，固定化細胞發(fā)酵無滯后期，在底物濃度為40g/L 時，丙酸產量提高了26.5%。聚酰胺是分子主鏈上含有酰胺基團的高分子化合物，氫鍵的存在使其具有較高的機械強度。在重復發(fā)酵過程中，微珠在攪拌和酸性條件下都具有很高的穩(wěn)定性，且與細胞結合的微珠即使經(jīng)過長時間的保存也能繼續(xù)作為接種劑，這在細胞保存方面具有相當大的優(yōu)勢。但缺少聚酰胺材料促進細胞吸附的自由官能團，細胞不能更好的吸附，可通過聚陽離子聚醚酰亞胺（PEI）進行微珠的修飾，以增強聚酰胺材料與細胞的電荷相互作用。F127-甲基丙烯酸雙脲酯（F127-BUM）水凝膠在單細胞培養(yǎng)和多細胞共培養(yǎng)中可重復使用，并具有較強的穩(wěn)定性（見圖2）[15]。在單細胞培養(yǎng)過程中，負載S.cerevisiae的水凝膠在以葡萄糖為底物發(fā)酵產乙醇時，長達一年的過程中，所有菌株生物發(fā)酵仍可運行，表明這些水凝膠材料具有較好的穩(wěn)定性[15]。在多細胞共培養(yǎng)體系中，上游大腸桿菌（Escherichia coli）可利用葡萄糖合成中間體3，4-二羥基苯丙氨酸，該中間體隨后被下游釀酒酵母（S.cerevisiae）代謝轉化為甜菜黃素[15]。與游離細胞發(fā)酵相比，在5 次重復使用后，固定化細胞仍保持了100%的甜菜黃素產量，而游離體系很快失去了產生甜菜黃素的能力。水凝膠固定化細胞的另一個優(yōu)勢在于能夠通過改變細胞裝載凝膠的比例來控制所需的細胞組成，從而解決生物合成能力不平衡的問題。例如，在E. coli/S.cerevisiae的共培養(yǎng)體系中，不同菌株的生長速率和底物代謝能力不同，這會導致菌群的結構和比例難以有效調節(jié)，導致微生物共培養(yǎng)系體的穩(wěn)定性和可控性差。通過水凝膠固定化細胞技術，可在空間上控制不同菌株，如E.coli∶S.cerevisiae為1∶6時，空間上調控共培養(yǎng)體系中不同微生物菌株的比例可將甜菜黃素的產量提高100%[15]。

表2 利用人工合成高分子材料固定細胞進行生物發(fā)酵

細胞固定化技術也可與3D打印技術進行結合。例如，利用F127-二甲基丙烯酸酯（F127-DMA）作為包埋材料，3D 打印機可打印一種多功能響應的包埋酵母的水凝膠。聚合物水凝膠對溫度和壓力的可逆刺激響應可使酵母細胞與水凝膠更易于結合，且印刷聚合物水凝膠的后續(xù)光交聯(lián)可使水凝膠更加堅固。在連續(xù)批次發(fā)酵過程中，這些酵母負載的活性物質在葡萄糖發(fā)酵成乙醇的過程中具有更好的代謝性能，且乙醇的收率維持在90%以上[16]。該細胞固定化平臺技術也可適用于其他工業(yè)菌株，以實現(xiàn)利用連續(xù)生物發(fā)酵合成其他高價值的化學品或生物燃料等。

1.2 無機載體材料在生物發(fā)酵領域的應用

無機載體材料由無機物單獨或混合其他物質制成，如多孔硅、活性炭和氧化鋁等（見表3）。材料多為多孔結構，具有較強的吸附能力和靜電引力，可將細胞吸附到載體表面，細胞吸附過程反應條件溫和、操作簡單且載體可反復利用。活性炭因其無毒、吸附性能和力學性能好等優(yōu)點而被廣泛使用[23]?；钚蕴坑捎诿芏容^低，在發(fā)酵液中具有良好的流動性，能更有效地捕獲細胞。以活性炭多孔顆粒載體對丙酮丁酸梭菌（C.acetobutylicum）進行固定化生物發(fā)酵為例，細胞濃度、碳源消耗速率、產氫氣量和丁醇產量都得到了顯著提高[24]。據(jù)報道，在C. acetobutylicum固定化發(fā)酵過程中，大多數(shù)參與編碼氫化酶、NADH-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶和鐵氧化還原蛋白的基因（hydGEF、hydA1、hydA2、fhuBDC、CA_P0141-CA_P0142）在基因表達強度上均得到上調[25]。

圖2 使用微生物單細胞培養(yǎng)和多細胞共培養(yǎng)負載水凝膠進行生物發(fā)酵

表3 利用無機材料固定細胞進行生物發(fā)酵

生物炭是生物質在有限氧條件下進行熱化學轉化而得到的一種具有碳質、多孔和穩(wěn)定的材料。由于高溫熱解，生物炭中形成了豐富的獨特微孔結構，具有較高的吸附和吸水能力。此外，官能團、礦物質和金屬也會引起生物炭堿度的變化，使生物炭具有較強的pH 緩沖能力、陽離子交換能力和電導率[26]。此外，生物炭表面富含官能團和較高的結晶度，這也可幫助促進生物膜的形成和電子轉移[27]。生物膜的形成進一步為微生物細胞創(chuàng)造一個內部保護環(huán)境，增強細胞對不利環(huán)境脅迫的耐受性[28]。例如，利用生物炭固定的C. beijerinckiiF-6對丁醇的耐受性顯著提高，且丁醇的生產效率也得到了提高。與游離細胞發(fā)酵相比，丁醇和產氫氣速率分別達到0.148g/(L·h)和0.299mmol/(L·h)，分別比對照組提高20.23%和48.76%[27]。另一個有趣的現(xiàn)象是生物炭還可以促進細胞之間的電子轉移，從而調節(jié)厭氧微生物菌群揮發(fā)性脂肪酸產物的分布[29]。

1.3 復合載體材料在生物發(fā)酵領域的應用

復合載體材料為了改善生物材料的本體或表面性質，由不同材料結合而成（見表4）。復合載體材料有利于材料性能優(yōu)勢互補，具備良好的生物相容性、較高的穩(wěn)定性和機械強度等優(yōu)點。聚乙烯醇（PVA）中的羥基和海藻酸鹽中的羧基通過酯化反應形成共價鍵，從而彌補使用單一聚合物固定化載體的缺點，膜的機械強度得到了提高[33]，而且可從兩種聚合物中優(yōu)化提取出最佳的膜。用PVA/海藻酸鈣混合物可形成優(yōu)良的微球，再采用“凍融”技術將鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）固定在微球中進行乳酸生物發(fā)酵[34]，乳酸的產量達到理論值的97.6%。與游離細胞相比，還原糖消耗提高了36.9%，乳酸的產量提高了37.1%，達到17.6g/L。從力學性能上看，PVA/海藻酸鈣微珠表現(xiàn)出較強的力學特性，固定化細胞有較高的機械穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，成功地應用于連續(xù)7個循環(huán)的分批發(fā)酵，表現(xiàn)出良好的細胞活力和較穩(wěn)定的乳酸產量[34]。

復合材料作為細胞固定化載體可以制備更大的可控制尺寸。木質纖維素基質可制備成納米和微米尺度的多孔的纖維素材料，其中微生物細胞可以進入形成的空腔，通過靜電和物理吸附固定。為提高乳清發(fā)酵生產乳酸的速率，提出了使用各種管狀纖維素和管狀纖維素/海藻酸鹽/聚乳酸復合材料作為實驗室固定化載體[35]。聚乳酸的使用是為了降低纖維素中微管的尺寸，其中的復合材料有望提高細胞在凝膠基質中的存活率。例如，以芒果提取的木質纖維素/海藻酸鈣/聚乳酸復合材料作為保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus）的固定化載體時，可促進乳糖培養(yǎng)基中乳酸發(fā)酵，獲得更高的乳酸產量和生產強度[35]。與游離細胞相比，乳酸的產量和生產強度分別提高了36.4%和36.5%。

2 高分子膜材料在生物發(fā)酵領域的應用

2.1 中空纖維膜

中空纖維膜作為固定化材料，與海藻酸鹽等傳統(tǒng)有機載體材料相比，具有機械強度和穩(wěn)定性高的特點。管狀中空纖維為細胞封裝提供了高的表面積和孔隙率，因此具有更高的底物擴散和傳質速率。中空纖維膜等聚合物載體上的細胞固定化還具有其他優(yōu)點：①較高的細菌密度和生產力；②連續(xù)運行，無細胞沖刷問題；③抑菌化合物接觸量低；④細胞的長期再生和再利用[38]。基于膜的固定化不需要任何共價交聯(lián)或離子鍵，細胞可以簡單地在膜壁內外擴散。此外，可以在固定化過程之前制備膜，從而在不影響細胞活力和生產力的前提下，更靈活地設計中空纖維膜的結構。例如，運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）可固定在中空纖維膜生物反應器（immobilized cell hollow fiber membrane bioreactor，ICHFMB）中，從而減輕木質纖維素預處理過程產生的抑制劑在乙醇生物發(fā)酵過程中對細胞的毒害作用[39]，并在高抑制劑濃度條件下達到理論乙醇產量的95%。且細胞在膜內的固定也非常穩(wěn)定，ICHFMB 在相同條件下可實現(xiàn)連續(xù)20 次運行。眾所周知，木質纖維素水解產物的抑制劑（糠醛、乙酸、5-羥甲基糠醛、香蘭素、丁香醛、4-羥基-3-甲氧基肉桂醛等）會對細胞產生毒性作用，而同時暴露在多個抑制劑下對細胞的毒害作用更加明顯。與游離細胞發(fā)酵相比，固定在中空纖維膜上的細胞因膜屏障作用，即使在水解抑制劑存在情況下，仍能表現(xiàn)出良好的生長和葡萄糖攝取速率[39]。在此發(fā)酵過程中，水解抑制劑可從膜孔緩慢的釋放，這可使固定化的運動發(fā)酵單胞菌逐漸適應水解抑制劑，具有更好的耐受性。ICHFMB在細胞固定化過程中具有很大的靈活性，通過改變水解液流量和膜表面積，可以提高生物發(fā)酵的性能。通過將細胞固定在不同的中空纖維膜組件上，可建立細胞與發(fā)酵液、細胞與細胞空間上的分離（見圖3）。同時浸沒式中空纖維膜生物反應器（submerged hollow fiber membrane bioreactor，SHFMB）可改善自由細胞體系木糖消耗速率較低的問題[40]。懸浮的Z.mobilis和木糖發(fā)酵菌（Cheffersomyces stipitis）在共培養(yǎng)中因為底物、產物和分解代謝物的抑制作用，在以葡萄糖和木糖混合物作為底物進行發(fā)酵中表現(xiàn)出較差的木糖利用。將細胞分別固定在中空纖維膜組件上，使兩者達到了空間分離的狀態(tài)，可顯著提高細胞的魯棒性，有效改善細胞浸沒式中空纖維膜（SHFMB）固定細胞的木糖利用效率。與游離細胞共培養(yǎng)相比，在總糖濃度為120g/L 時，木糖消耗量從3%提高到70%，且固定化細胞在連續(xù)12批生物發(fā)酵后，其發(fā)酵性能仍保持穩(wěn)定[40]。

表4 利用復合材料固定細胞進行生物發(fā)酵

浸沒式中空纖維膜生物反應器（submerged hollow-fiber membrane bioreactors，s-HF/MBRs）可應用在多細胞體系的生物發(fā)酵過程中，克服多細胞培養(yǎng)體系中菌株生長特征不同、產物抑制和底物競爭等問題[41]。該體系中，上游酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）在A反應器利用蔗糖合成中間體丁酸鹽，該中間體隨后被蠕動泵運輸?shù)紹 反應器后被下游巨型球菌（Megasphaera hexanoica）吸收轉化為己酸（見圖4）。利用s-HF/MBRs 反應器合成己酸的濃度可升高至10.08g/L，生產強度達到0.69g/(L·h)。該研究為首次在浸沒式中空纖維膜生物反應器中利用微生物共培養(yǎng)體系發(fā)酵合成己酸[41]。

2.2 微米/納米纖維膜

圖3 利用中空纖維膜模塊對微生物進行分離和多細胞共培養(yǎng)生物生產

圖4 浸沒式中空纖維膜裝置

近年來，微米/納米尺度材料吸引了廣泛的關注。由于其具有較大的表面積與體積比，可實現(xiàn)細胞的高負載。微米級材料和納米級材料的精細多孔結構可使底物更易于擴散進入細胞，并且其低擴散阻力使發(fā)酵具有更高的反應速率和轉化率。此外，與顆粒相比，它們更容易從反應介質中回收，具有良好的連續(xù)操作性能。例如，利用聚丙稀微纖維膜作為載體材料固定化琥珀酸放線桿菌（Actinocacillus succinogenes），以葡萄糖為底物發(fā)酵產琥珀酸的過程中，琥珀酸的收率和生產強度分別達0.82g/g 和1.04g/(L·h)[42]。同時，采用補料間歇策略可進一步構建實驗室規(guī)模的微纖維膜生物反應器。為了使細菌能更好地固定在微纖維膜材料上，可對纖維膜進行電暈處理使其膜上帶正電，進而可使帶負電的細胞通過靜電作用更好地固定在聚丙烯微纖維膜上。此外，細胞固定化膜具有良好的再利用穩(wěn)定性，在發(fā)酵多個循環(huán)后無活性損失[42]。介孔載體與工業(yè)生物技術的相互結合，為工業(yè)菌株在生物發(fā)酵體系中的可重復利用提供了更廣闊的前景。

電紡納米纖維膜作為組織工程的候選材料，可以模擬天然的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），在過去幾十年中得到了廣泛的研究。電紡納米纖維膜具有高孔隙率和疏松的三維多孔結構等優(yōu)點。這種獨特的結構可以模擬自然的ECM結構，為細胞固定提供載體[43]。細胞對局部的微米尺度、亞微米尺度和納米尺度的表面形貌天生敏感[44]，表面形貌的改變會引發(fā)不同的細胞行為，包括細胞黏附、細胞定位、細胞運動、調節(jié)轉錄活性和基因表達的細胞內信號通路的改變。因此，電紡納米纖維膜是一種極好的細胞黏附、增殖和表達基質成分的候選材料。已有研究將電紡醋酸納米纖維作為L.plantarum生物膜形成的載體材料。納米纖維膜被證明是細菌生物膜的良好載體，具有很高的穩(wěn)定性[45]，在整個可重復使用批次中，發(fā)酵液中的活細胞約為11 lg(CFU/g)，比標準值高出4 lg(CFU/g)，生物膜與納米纖維形成一個緊密的結構。與游離細胞發(fā)酵相比，生物膜固定化發(fā)酵的發(fā)酵時間縮短2.8h，21天后植物乳桿菌在發(fā)酵乳中的存活率比以浮游細菌高36 倍[45]。微米/納米纖維膜是生物技術和發(fā)酵工程中固定化細菌生物膜的理想載體材料，在微生物學和發(fā)酵工程中有著巨大的應用前景。

3 結語與展望

與傳統(tǒng)的固定化材料相比，新型高分子多孔膜材料介導的細胞固定化技術在生物發(fā)酵領域展示出巨大的應用潛力。近幾年，隨著聚合物合成技術的發(fā)展，越來越多性能優(yōu)良的新型聚合物載體被開發(fā)，進一步促進細胞固定化技術的發(fā)展和應用。目前，在生物發(fā)酵過程中，應用最廣泛的膜生物反應器還局限在實驗室規(guī)模的應用，不具有廣泛的工業(yè)化應用能力。新型高分子多孔膜材料介導的細胞固定化技術將極大地提高細胞密度和固定化細胞的性能，在生物技術領域具有廣闊的應用前景。近年來，在工業(yè)生物技術領域，越來越多的研究報道了利用人工混菌體系合成有用化學品和生物燃料，這也是生物發(fā)酵領域中重要的研究方向之一。人工混菌體系可通過勞動分工完成復雜工作，如木質纖維素的直接降解轉化、長代謝路徑化學品的合成等，且人工混菌體系處在動態(tài)平衡的一種狀態(tài)，這使微生物對復雜環(huán)境具有更好的適應性。然而由于不同微生物之間存在底物利用競爭、營養(yǎng)需求條件的不同，如氧氣、pH 和水解抑制劑毒害等，人工混菌體系的穩(wěn)定性和可控性仍存在巨大挑戰(zhàn)。通過膜材料介入構建有氧和厭氧的真菌-細菌共培養(yǎng)體系，已經(jīng)實現(xiàn)直接利用木質纖維素合成乳酸等有用化學品[46]，這也為進一步構建和設計具有可控性和魯棒性的人工混菌體系提供了借鑒，如可以根據(jù)菌體的大小、菌體電荷不同設置梯度膜和不同電荷性質的膜材料，從而設計與構建細菌-酵母或者表面帶正電荷-負電荷菌的共生體系，從而進一步提高人工混菌體系的魯棒性和穩(wěn)定性。

材料介導細胞固定化技術為工業(yè)生物技術領域提供了新的啟發(fā)。固定化細胞載體材料的性質和固定化過程是生物發(fā)酵性能的關鍵。因此，在選擇固定載體材料時需要全方面考慮材料的性能，如力學性能、穩(wěn)定性和粗糙度等。材料介導的細胞固定化技術已被證明可有效提高固定化細胞在復雜環(huán)境的適應性和生長代謝性能。在未來，具有制備工藝簡便、穩(wěn)定性強及可連續(xù)操作的細胞固定化技術將在生物發(fā)酵領域得到更廣泛的應用。