何肖微，王司辰，趙大勇*

(1.河海大學水文水資源學院，江蘇 南京 210098；2.河海大學 水利工程實驗教學中心，江蘇 南京 210098；3.河海大學 水利學科專業(yè)實驗教學中心，江蘇 南京 210098)

浮游細菌是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，并且在生源要素的生物地球化學循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。淡水湖泊中的浮游細菌群落組成往往會隨時空因素而變化[1-5]。許多因素都可以影響淡水湖泊中的浮游細菌群落組成，如營養(yǎng)鹽、鹽度、溶解性有機碳、生產力和水溫等[2,6-7]。此外，已有的關于大型淺淡水湖泊中浮游細菌群落組成的研究結果表明：水生植物的存在或缺失會導致浮游細菌群落組成發(fā)生顯著變化[5]。這說明包括水生植物在內的許多因素導致的生境異質會影響湖泊的浮游細菌群落組成[8]。

水生植物是淡水湖泊中的重要初級生產力，對生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性有重要影響[9-10]。在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，水生植物為微生物提供了多種微生境，并通過為它們提供必要的基質來影響浮游細菌的豐度和活性[11-13]。研究[14]表明：水生植物釋放的化合物可以作為直接改變浮游細菌群落的選擇性因子。綜合這些研究結果可形成如下科學假設，即水生植物可能驅動湖泊中的浮游細菌群落變化。

目前，關于水生植物對湖泊浮游細菌群落影響的研究還比較少。作者從南京花神湖采集2種常見水生植物：沉水植物苦草(Vallisnerianatans)和飄浮植物浮萍(Lemnaminor)；構建包含植物的微宇宙模擬體系，在不同的培養(yǎng)時間點采集水樣，對其理化指標和浮游細菌群落組成進行分析，對比不同處理組浮游細菌群落多樣性及組成的差異，探討水生植物對湖泊浮游細菌群落的影響，以期為豐富湖泊微生物生態(tài)學基礎理論提供參考數(shù)據。

1 實驗

1.1 樣品采集

在南京花神湖使用彼得遜采泥器采集沉積物樣品，并收集足量的湖水、苦草和浮萍幼苗，立即運回實驗室用于構建微宇宙模擬體系。將采集的沉積物混勻、過篩(100目)后均勻分裝到直徑20 cm、高度50 cm的圓柱狀有機玻璃微宇宙模擬體系中，沉積物深度為10 cm左右。依次向微宇宙模擬體系中加入采集的花神湖湖水(高度約10 cm)和滅菌純凈水(高度約30 cm)。待體系穩(wěn)定3 d后，挑選完整、健康的水生植物苦草和浮萍進行移植，移植前用過氧乙酸對苦草和浮萍幼苗葉片等部位進行滅菌處理，以只包含花神湖湖水和沉積物、未移植水生植物為空白對照，3種體系各設置1個重復組。待植物生長穩(wěn)定后，將其中一組模擬體系設置為添加氨氮處理組，每4 d向其中添加2 mg·L-1的氨氮。分別在模擬體系培養(yǎng)穩(wěn)定后的第14 d、第35 d和第70 d采集不同體系中的水樣并儲存在無菌聚丙乙烯瓶中，用于提取DNA和理化指標測定。

1.2 理化指標測定方法

1.3 DNA提取和測序

使用0.22 μm聚碳酸酯濾膜(Millipore,Billerica,MA,USA)過濾水樣，參照試劑盒Water DNA Kit(OMEGA bio-tek)說明書進行DNA提取。采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)對細菌的16S rRNA基因進行PCR擴增。50 μL的PCR反應體系包含：10 μL的5×Prime STAR Buffer(plus Mg2+)、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.4 μmol·L-1上下游引物、2.0 U TaKaRa Taq DNA聚合酶，加ddH2O到50 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；72 ℃最終延伸7 min。每個樣品做3個重復，然后充分混合。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在羅氏454 FLX Titanium平臺上進行高通量測序。所有的原始測序結果文件均已上傳至美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據庫，檢索號為SRP091979。

1.4 高通量測序序列處理

依據Mothur軟件包的SOP流程(https://mothur.org/wiki/454_sop/)對高通量測序序列進行預處理。首先，將下機原始測序文件進行降噪和修剪處理，刪除測序質量較低的序列(平均質量<27)和較短的序列(<200 bp，不包括引物和barcode)，并刪除單一堿基連續(xù)出現(xiàn)8次以上的序列。使用NAST算法將剩余序列與SILVA 16S rRNA基因模板進行對齊。為了加速后續(xù)計算過程，使用 ‘pre.cluster’命令進一步精簡數(shù)據，然后使用 ‘chimera.uchime’ 命令去除嵌合體序列。使用RDP在線數(shù)據庫(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)，應用基于80%的cutoff閾值獲得細菌群落分類學信息。使用最大鄰近距離法在基于3%的差異值水平上劃分操作分類單元(OTU)。按照全部樣品中獲得的最小序列數(shù)進行序列隨機抽取采樣，使得文庫中各個樣品的序列數(shù)一致，以方便進行α和β多樣性指數(shù)的計算。

1.5 統(tǒng)計分析

使用Mothur軟件包的‘summary.single’命令計算細菌群落的豐度(OTU數(shù))和多樣性指數(shù)(Chao1)。運用R軟件中的‘vegan’包計算兩兩細菌群落之間的β多樣性(基于Bray-Curtis距離)，使用非度量多維尺度分析(NMDS)進行可視化，使用典范對應分析(CCA)評價環(huán)境因子對細菌群落組成的影響。使用‘adonis’命令進行非參數(shù)多元方差分析(PerMANOVA)，判斷采樣時間和添加氨氮兩因素對浮游細菌群落影響的大小。

2 結果與討論

2.1 浮游細菌群落分類學分析

基于80%的cutoff閾值，對浮游細菌群落中各序列的分類學信息進行分析，并計算不同處理組中浮游細菌群落各個門所占的相對豐度，結果如圖1所示。

圖1 不同處理組中浮游細菌群落門類相對豐度柱狀圖(“+”代表添加氨氮處理組)Fig.1 Relative abundance of bacterioplankton community at phylum level in different treatment groups(“+”reprents ammonia-nitrogen addition treatment group)

由圖1可知：變形菌門(Proteobacteria)在所有處理組中的平均相對豐度最高，達到(47.00±19.22)%，其包含的3個綱α-變形菌綱(α-Proteobacteria)、β-變形菌綱(β-Proteobacteria)和γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)的相對豐度在各個處理組中都較高，平均豐度分別達到了(17.30±12.11)%、(23.80±17.12)%和(5.20±6.21)%；放線菌門(Actinobacteria)(16.30±16.48)%、藍藻門(Cyanobacteria)(10.70±13.37)%和擬桿菌門(Bacteroidetes)(10.10±7.48)%也是本次發(fā)現(xiàn)的浮游細菌群落中的主要優(yōu)勢類群；β-Proteobacteria在第14 d的所有處理組中的相對豐度均較高；放線菌門在第35 d和第70 d的空白處理組中的相對豐度較高；綠菌門(Chlorobi)在第14 d的浮萍處理組中的相對豐度較高；藍藻門在第70 d的浮萍處理組中的相對豐度較高。研究[15-17]發(fā)現(xiàn)：變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍藻門和疣微菌門是湖泊水體浮游細菌群落中的常見優(yōu)勢類群，本研究發(fā)現(xiàn)的湖泊浮游細菌優(yōu)勢類群與上述研究基本一致。此外，湖泊的營養(yǎng)狀態(tài)和溫度等環(huán)境因子也會對浮游細菌群落組成有較大影響[18]。

由于在門的分類學水平上無法了解具體浮游細菌種屬的相對豐度變化情況，因此，進一步篩選出每個處理組中平均相對豐度最高的10個屬，比較它們在不同處理組中的相對豐度差異，以熱圖的形式來呈現(xiàn)，結果如圖2所示。

由圖2可知：(1)擬桿菌門中的Sediminibacterium屬、Fluviicola屬以及Flavobacterium屬在第14 d處理組中的相對豐度較高(>1%)，但在第35 d處理組中的相對豐度很低(<1%)。有研究[16,19]顯示，擬桿菌豐度與水生植物生物量成正比關系，水生植物可以通過改善水質以及釋放分泌物來影響浮游細菌群落組成。(2)變形菌門中的LD28_freshwater_group、Methylophilus屬和Methylotenera屬在第14 d苦草處理組中的相對豐度較高(>1%)，變形菌門中的Novosphingobium屬和Legionella屬在第35 d苦草處理組中的相對豐度較高(>1%)，變形菌門中的Sphingomonas屬在第35 d空白處理組中的相對豐度較高(>1%)。有研究[20]顯示，變形菌門在低營養(yǎng)環(huán)境中更易獲取營養(yǎng)，成為優(yōu)勢類群。

圖2 不同處理組中優(yōu)勢菌屬的相對豐度熱圖(“+”代表添加氨氮處理組)Fig.2 Relative abundance of dominant bacterioplankton at genus level in different treatment groups(“+”reprents ammonia-nitrogen addition treatment group)

2.2 浮游細菌群落組成分析

為了比較不同處理組中浮游細菌群落的組成差異，通過非度量多維尺度分析比較苦草、浮萍和空白組不同采樣時間點的細菌群落組成差異，結果如圖3所示。

圖3 不同處理組中浮游細菌群落組成差異Fig.3 Differences of bacterioplankton community composition in different treatment groups

由圖3可知：第14 d時的浮游細菌樣品趨向于聚類在一起，說明實驗初期浮游細菌群落組成較為相似；第35 d和第70 d時的浮游細菌樣品聚類程度不如第14 d時的緊密，且同一種水生植物處理組的樣品呈現(xiàn)聚集。這可能是由于水生植物在實驗中后期對水體浮游細菌群落影響作用增強而導致的。

為了探究采樣時間和添加氨氮兩因素對水體浮游細菌群落影響作用的大小，通過非參數(shù)多元方差分析對比兩因素對水體浮游細菌群落影響作用的大小，結果見表1。

表1 采樣時間和添加氨氮兩因素對水體浮游細菌群落影響作用的比較

由表1可知：采樣時間對水體浮游細菌群落具有顯著影響(P<0.01)，而添加氨氮對水體浮游細菌群落無顯著影響(P>0.05)。氨氮作為重要的營養(yǎng)因子，對湖泊水生植物和浮游細菌群落都會產生影響。但是，本研究中的微宇宙模擬體系中存在沉積物和水生植物，這兩者都會迅速吸收添加入系統(tǒng)的氨氮，從而使得添加氨氮處理組與對照組中水體氨氮濃度無太大差異。

2.3 浮游細菌群落的豐度和多樣性分析

經過降噪、去除嵌合體以及非細菌序列之后，獲得的單個樣品的序列數(shù)在3 170～5 614之間。依據最少序列數(shù)3 170進行隨機重采樣，以此計算出各個浮游細菌群落樣品的豐度和多樣性指數(shù)。根據表1中的結果，添加氨氮對水體浮游細菌群落無顯著影響。因此，在分析浮游細菌群落的豐度和多樣性指數(shù)時，將有無氨氮添加的兩組樣品合并后進行分析，結果如圖4所示。

由圖4可知：在第14 d浮游細菌樣品中，浮萍處理組浮游細菌群落的豐度(OTU數(shù))和多樣性指數(shù)(Chao1)比苦草處理組和空白處理組都要高；隨后，各個處理組樣品中的浮游細菌群落的豐度和多樣性指數(shù)均開始下降，但浮萍處理組樣品中浮游細菌群落的多樣性指數(shù)一直比另外兩個處理組要高；在第70 d時，苦草處理組浮游細菌群落的多樣性指數(shù)出現(xiàn)回升，兩個水生植物處理組中浮游細菌群落的多樣性指數(shù)接近一致。這反映了不同水生植物對浮游細菌群落多樣性的影響機制不同。培養(yǎng)初期，浮萍處理組浮游細菌大量繁殖，浮萍生長消耗水中營養(yǎng)物質的同時，葉片也能為浮游細菌提供定殖的場所；隨著時間推移，浮萍生長改變了水體的pH值和溶解氧等環(huán)境因子，不同細菌類群對pH值的響應不同，水體pH值的改變也是影響浮游細菌群落變化的重要因素[21-23]。而苦草屬于沉水植物，生長初期主要吸收沉積物中的營養(yǎng)鹽，與浮游細菌的生態(tài)位不重合，這也能合理解釋苦草處理組與空白處理組體系前中期(14 d和35 d)的浮游細菌群落多樣性相似[10]。兩個水生植物處理組在第70 d呈現(xiàn)出相似的多樣性水平，均略高于空白處理組，說明經過70 d的培養(yǎng)，兩個水生植物體系趨于穩(wěn)定，并為浮游細菌提供了一定的生態(tài)位，增加了浮游細菌群落的多樣性。此外，水生植物與浮游藻類間的競爭關系以及水生植物的化感作用等也能間接影響浮游細菌群落多樣性的變化[24]。

圖4 不同處理組浮游細菌群落豐度和多樣性指數(shù)隨時間的變化Fig.4 Variations of abundance and diversity index of bacterioplankton community with time in different treatment groups

2.4 環(huán)境因子對浮游細菌群落組成的影響分析

為了探究微宇宙模擬體系中水質因子的變化對浮游細菌群落組成的影響，測定了每個采樣時間點體系中的主要水質因子，結果見表2。

表2 不同采樣時間點各處理組中的主要水質因子/(mg·L-1)

應用典型對應分析探究水質因子的變化對浮游細菌群落組成的影響，并通過排序圖進行呈現(xiàn)，結果如圖5所示。

圖5 不同處理組中浮游細菌群落與環(huán)境因子的典范對應分析圖Fig.5 Canonical correspondence analysis of bacterioplankton community and environmental factors in different treatment groups

由圖5可知，總體上，不同時間序列處理組(第14 d、第35 d和第70 d)的細菌群落分別聚類在一起。觀察樣品在沿兩個軸方向的分布上，可以發(fā)現(xiàn)實驗初期的第14 d處理組的細菌群落沿CCA1軸分布，隨后的第35 d和第70 d處理組的細菌群落大致沿CCA2軸分布，呈現(xiàn)出明顯的隨時間演替規(guī)律，說明實驗初期與實驗中后期的浮游細菌群落整體上受不同環(huán)境因子的影響。

進一步應用envfit函數(shù)對環(huán)境因子與排序軸的相關性進行檢驗，結果發(fā)現(xiàn)：氨氮、總磷和總有機碳是影響水體中浮游細菌群落組成的主要環(huán)境因子(表3)。一方面，氮和磷會增加異養(yǎng)細菌的生物量并導致其群落組成的變化[25]。另一方面，水體中氮、磷的變化也能通過影響浮游植物群落組成而間接影響浮游細菌群落。薛銀剛等[26]在太湖竺山灣的研究顯示，總磷含量顯著影響了浮游細菌群落的結構。

表3 環(huán)境因子與排序軸之間的相關性

3 結論

構建了包含淡水湖泊中兩種典型水生植物苦草(Vallisnerianatans)和浮萍(Lemnaminor)的微宇宙模擬體系，結合高通量測序技術，探討了水生植物對湖泊浮游細菌群落組成的影響。結果表明：不同采樣時間及處理組中，浮游細菌群落中的優(yōu)勢類群不同；氨氮的加入對浮游細菌群落的影響沒有采樣時間大；實驗初期，浮萍處理組的浮游細菌群落多樣性指數(shù)比苦草和空白處理組都要高，隨著實驗的進行，各個處理組的浮游細菌群落多樣性指數(shù)總體開始下降并最終趨于一致；氨氮、總磷和總有機碳是影響浮游細菌群落組成的主要環(huán)境因子。