羅文濤，馮菊紅*，王理想，何少男，孫錕輝，劉 祺，胡學(xué)雷

(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

桑葉又名冬桑葉、霜桑葉、鐵扇子、枯桑葉等，是?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉子。我國是世界上最早種植桑樹的國家，桑樹在我國大部分地區(qū)多有種植，尤其是長江中下游地區(qū)和四川盆地。桑葉產(chǎn)量豐富，除了作為蠶的主要食物外，也是一種重要的中藥材和保健食品。桑葉作為中藥使用已有4 000多年的歷史，在世界上第一部藥典《唐本草》中記載了桑葉的藥用功效。桑葉味甘、苦，性寒，能疏散風(fēng)熱，熱肺潤燥，清肝明目，平抑肝陽。桑葉中含有多種藥理活性成分，主要是黃酮類、生物堿類、甾體和多糖類化合物。其中，黃酮類化合物的含量占桑葉干重的2%左右，是桑葉中化學(xué)成分研究最多、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的一類天然產(chǎn)物。黃酮類化合物的基本骨架為2-苯基色原酮(圖1)。

圖1 黃酮類化合物的基本骨架Fig.1 Basic skeleton of flavonoids

桑葉黃酮類化合物(mulberry leaf flavonoids,MLFs)多含酚羥基，顯酸性，且其酸性強弱與酚羥基的數(shù)目和位置有關(guān)。MLFs苷元多為結(jié)晶性固體，糖苷化后多為無定形粉末，且糖苷化后水溶性會增強。MLFs主要包括蕓香苷、桑色素和槲皮素等，具有抗氧化、抗癌和改善心血管功能等多種藥理學(xué)作用，有較好的研究價值和應(yīng)用前景。作者就近15年來MLFs的提取方法、分離純化方法、含量檢測和藥理學(xué)作用等方面研究進(jìn)行簡要綜述。

1 MLFs的提取方法

MLFs的提取方法主要包括有機溶劑法、超聲波輔助法、微波輔助法、超臨界CO2法等。研究[1]表明，影響MLFs提取的因素主要有提取溶劑、提取溫度、提取時間和料液比等。使用不同種類、不同濃度的溶劑提取的MLFs含量有所不同。提取溫度對分子熱運動有顯著影響，當(dāng)提取溫度較低時，溶劑分子運動較緩慢，提取的MLFs含量較低；當(dāng)提取溫度過高時，有可能會破壞MLFs的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一般情況下，提取時間越長，MLFs溶出越充分，但同時也增加了雜質(zhì)的溶出。溶劑用量越多，提取的MLFs含量越高，但雜質(zhì)含量也越高。

1.1 有機溶劑法

傳統(tǒng)的水提取法因部分MLFs組分不溶于水，導(dǎo)致MLFs浸出率較低。有機溶劑法使用甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑提取，可以提高M(jìn)LFs含量。該法操作簡便，易于放大。Kobus-Cisowska等[2]比較了小分子醇、丙酮和水等溶劑對提取MLFs的影響，結(jié)果表明，以丙酮為提取溶劑時，MLFs含量最高；以乙醇為提取溶劑時，MLFs的抗氧化活性最高；以水為提取溶劑時，MLFs的抗氧化活性最低。Cui等[3]優(yōu)化了MLFs的提取條件，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為39.3%、料液比為1∶34.6 (g∶mL，下同)、提取溫度為70.85 ℃、提取時間為120.18 min的最優(yōu)條件下，MLFs含量最高，為50.52 mg·g-1。

1.2 超聲波輔助法和微波輔助法

超聲波輔助法的原理是當(dāng)超聲波作用于介質(zhì)時，會產(chǎn)生正負(fù)不同的壓強相位，撕裂介質(zhì)，形成空洞，并使溫度升高和攪拌加劇，具有提取效率高、耗時較短、可提取熱不穩(wěn)定成分等特點。張齊[4]在提取溶劑為75%乙醇、料液比為1∶25、提取溫度為70 ℃的條件下超聲提取MLFs 1.5 h，MLFs含量為2.96%。

微波輔助法的原理是介質(zhì)中的極性分子隨電磁場頻率的變化而改變排列取向，導(dǎo)致分子運動和摩擦，產(chǎn)生熱效應(yīng)，具有提取效率高、耗時較短、溶劑用量少等特點。陳菁菁等[5]對比了有機溶劑法和微波輔助法對MLFs的提取效果，在提取溶劑為70%乙醇、料液比為1∶12的條件下，當(dāng)微波輔助功率為450 W、提取溫度為60 ℃、提取時間為20 min時，MLFs含量為2.87%；而采用有機溶劑在90 ℃下回流提取2 h，MLFs含量為1.85%，微波輔助法提取MLFs含量更高，較有機溶劑法提高了55%。

超聲-微波協(xié)同法結(jié)合了超聲波輔助法和微波輔助法，既有超聲波輔助法的空化效應(yīng)，又有微波輔助法的熱效應(yīng)，具有提取效率高、耗時短等特點。李莉等[6]采用超聲-微波協(xié)同法提取MLFs，在提取溶劑為65%乙醇、提取功率為400 W、提取時間為12 min、料液比為1∶10的條件下，MLFs含量為3.07%。

1.3 超臨界CO2法

超臨界CO2法以超臨界CO2流體為萃取劑，通過改變CO2流體溫度或壓強，使超臨界CO2流體密度發(fā)生變化，進(jìn)而改變其溶解能力。該法中CO2無毒害作用，且對提取物的破壞較小。王昕宇等[7]采用超臨界CO2法萃取MLFs，在壓力為35 MPa、溫度為45 ℃、夾帶劑為200 mL、CO2流量為10 kg·h-1的條件下處理300 g桑葉，MLFs含量為7.68%。表明，超臨界CO2法的提取效率優(yōu)于有機溶劑法，且無溶劑殘留，可用于MLFs的大規(guī)模提取。

1.4 其它提取方法

熊知行等[8]采用酶法提取MLFs，發(fā)現(xiàn)加入纖維素酶能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高M(jìn)LFs的提取效率。

堿提酸沉法：MLFs為酸性，可用弱堿溶液為提取溶劑進(jìn)行提取，再在酸性條件下沉淀析出。該法提取的雜質(zhì)較多，污染較大，若提取溶劑堿性太強，會破壞黃酮母核；若沉淀時酸性太強，會生成烊鹽，使MLFs重新溶解。

2 MLFs的分離純化方法

通過不同方法提取的MLFs是黃酮類化合物的混合物，經(jīng)初步分離純化得到MLFs粗品。如果要得到結(jié)構(gòu)單一的黃酮類化合物，需要對MLFs進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

2.1 初步分離純化

從提取液中分離MLFs粗品主要采用大孔吸附樹脂柱層析法。目前，關(guān)于大孔吸附樹脂方面的研究主要集中于大孔吸附樹脂的種類、分離純化溫度、洗脫劑種類及濃度、料液比等的選擇和優(yōu)化。影響樹脂吸附性能的因素包括樹脂的極性、骨架結(jié)構(gòu)、比表面積和平均孔徑大小，以及被吸附物質(zhì)的極性和分子大小等。一般而言，樹脂與分子極性越相似，越易吸附，但越難解析；樹脂的相對比表面積越大，吸附能力越強；樹脂的相對孔徑越大，擴散速度越快，但選擇性越低。王俊等[9]采用樹脂吸附法分離純化MLFs，選擇H103型樹脂固定床，在上樣流速為9 mL·min-1、MLFs初始濃度為6.05 mg·mL-1、洗脫劑為60%乙醇、洗脫流速為4.5 mL·min-1的條件下，MLFs收率為90.57%，純度為76.33%。

除了大孔吸附樹脂外，分離MLFs粗品還可用硅膠、聚酰胺、纖維素粉作為吸附劑或載體，此外，氧化鋁、氧化鎂及硅藻土等也有應(yīng)用。

2.2 進(jìn)一步分離純化

黃酮類化合物的骨架結(jié)構(gòu)、骨架上的酚羥基和糖基等是決定其物化性質(zhì)的重要因素，使其顯示出不同的極性、酸性、分子量和化學(xué)反應(yīng)性。根據(jù)這一特性，可采用下列方法對MLFs進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，以得到單一組分。

(1)溶劑萃取法：使用不同極性的溶劑，經(jīng)過反復(fù)萃取，分離出不同組分。該法很難直接分離出單一組分，常結(jié)合色譜法或重結(jié)晶法進(jìn)一步分離。

(2)色譜法：Ju等[10]采用液質(zhì)聯(lián)用法對12種韓國MLFs組分進(jìn)行了定性和定量分析。其中，含量最高組分的是蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-(6′-O-丙二酰)葡萄糖苷。

(3)梯度pH值萃取法：根據(jù)MLFs不同組分的酸性差異，可以采用不同酸性的洗脫劑將其分離。常用洗脫劑有NaHCO3、Na2CO3、稀NaOH和濃NaOH溶液[11]。

(4)高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法：利用電泳和電滲流現(xiàn)象，不同MLFs組分在不同電場力的作用下被分離。該法分離效率高，進(jìn)樣量極少，其柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜(HPLC)法。張軍等[12]采用HPCE法對不同種類、不同時期的MLFs進(jìn)行分離和測定，緩沖液為pH 值8.62的磷酸二氫鈉和硼砂溶液，溫度為25 ℃，壓力為20 kV，檢測波長為245 nm，8 min內(nèi)組分分離完全，測得湖桑品種中蘆丁和槲皮素含量最高，并且10月份采摘桑葉中蘆丁和槲皮素含量最高。

(5)微乳薄層層析法：以微乳為展開劑，用薄膜進(jìn)行分離。該法分離效果好，靈敏度高。李升鋒等[13]采用微乳薄層層析法分離MLFs，將微乳層析液調(diào)酸后，經(jīng)聚酰胺薄膜分離。結(jié)果顯示，分離出12個斑點，分離效果較好，其中蘆丁含量較高。

3 MLFs的含量檢測

MLFs含量檢測不僅與提取、純化方法有關(guān)，也與桑葉本身所含MLFs含量有關(guān)。桑葉的種類、部位以及光照強度、土壤環(huán)境和季節(jié)變化等都是影響MLFs含量的重要因素[14]。在一定范圍內(nèi)，MLFs含量隨光照強度的增大而升高。Krajnc等[15]研究發(fā)現(xiàn)，對桑樹進(jìn)行修剪，蛋白質(zhì)和MLFs含量會升高。Przeor等[16]研究發(fā)現(xiàn)，白桑葉在60 ℃下干燥時，MLFs含量最高。

3.1 紫外可見分光光度法

紫外可見分光光度法的原理是部分MLFs能與鋁離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)顯色，其顏色的深淺與MLFs含量呈比例，故可以通過測定吸光度計算MLFs含量。該法具有操作簡單、重現(xiàn)性好等特點。穆建峰[17]確定的MLFs最佳提取條件為：料液比1∶20、提取溫度70 ℃、提取溶劑50%丙酮、超聲時間40 min，并采用硝酸鋁顯色法測定MLFs含量，檢測波長為510 nm，得回歸方程為y=11.066x-0.0001(R2=0.9995)，測得MLFs含量為2.78%。張國權(quán)等[18]采用三氯化鋁比色法測定MLFs含量，檢測波長為400 nm，得回歸方程為y=0.0298x-0.0018(R2=0.9995)，MLFs含量在0.001～0.016 g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 熒光光度法

紫外線照射物質(zhì)后使其處于激發(fā)態(tài)，在去激發(fā)過程中會發(fā)射反映物質(zhì)特性的熒光，若該物質(zhì)不發(fā)射熒光，可使用熒光染料與其生成絡(luò)合物。熒光光度法利用這一性質(zhì)，在有鋁離子存在的條件下測定MLFs含量。該法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點。王艷[19]采用熒光光度法測定MLFs含量，標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁，激發(fā)波長為436 nm，發(fā)射波長為483 nm，得回歸方程為y=17.913x+1.388(R2=0.9999)，檢測限為1.36×10-9mol·L-1。

3.3 高效液相色譜法

HPLC法可分離多種組分，并進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好。Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲處理0.5 h的酸性甲醇是HPLC法檢測MLFs的最佳流動相。Zhang等[21]利用手性HPLC分離和檢測了MLFs中的立體異構(gòu)體。Kim等[22]采用酶法提取桑葉有效成分，通過HPLC法分離并檢測了5種組分。

4 MLFs的藥理學(xué)作用

黃酮類化合物具有多種藥理學(xué)作用，包括改善心血管功能、保護(hù)肝臟、抗炎、抗菌、抗病毒、雌激素樣作用、瀉下作用和解痙作用等[23-24]。

4.1 抗氧化

MLFs具有減少或清除自由基，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性和提高細(xì)胞抗氧化能力，減少細(xì)胞和組織損傷，進(jìn)而減少心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生，延緩衰老和延長壽命。Hosseinzadeh等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MLFs組分中的蘆丁可抑制自由基對肝、胃腸道等的損害。Chon等[26]研究了桑葉提取物中總酚含量與清除自由基能力的關(guān)系，結(jié)果表明，總酚含量越高，清除自由基能力越強。此外，還有研究[27]表明，桑葉提取物經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理，槲皮素含量明顯提高，桑葉提取物的胞內(nèi)抗氧化能力增強。

4.2 降血脂

MLFs可以抑制腸道內(nèi)膽固醇的吸收，降低血脂濃度，減少高血脂癥的發(fā)生。此外，MLFs可通過清除體內(nèi)自由基、螯合金屬離子、影響SOD活性來提高血管內(nèi)高密度脂蛋白(HDL)與低密度脂蛋白(LDL)的比率，預(yù)防動脈粥樣硬化。研究[28]表明，MLFs能改善小鼠的腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。Hu等[29]通過大鼠試驗，發(fā)現(xiàn)MLFs可以通過減少膽固醇的累積治療肝類疾病。

4.3 降血糖

MLFs可以抑制胰島β-細(xì)胞凋亡，減少血糖攝入，降低血糖濃度。此外，MLFs可通過清除體內(nèi)多余自由基、提高SOD活性和提高細(xì)胞抗氧化能力來減少對肝臟和胰島細(xì)胞的破壞，提高機體降血糖能力。研究[30]表明，MLFs可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群，改善由糖尿病引起的并發(fā)癥。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[31-32]報道，MLFs可以調(diào)節(jié)糖代謝，校正高血糖癥。Kim等[33]經(jīng)體外降糖性能實驗，發(fā)現(xiàn)MLFs具有降糖活性。

4.4 美白

MLFs可以通過抑制體內(nèi)的酪氨酸酶活性，抑制酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素，起到美白作用。此外，MLFs可通過清除自由基和提高細(xì)胞抗氧化能力，減緩由自由基攻擊細(xì)胞導(dǎo)致的衰老，延長壽命。邢凱等[34]以MLFs為原料，制備了具有控脂美白效果的面膜，測試了其pH值、熱穩(wěn)定性、黏度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和刺激性。結(jié)果表明，面膜的pH值適宜、熱穩(wěn)定性較強、黏度適宜、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好、刺激性適宜，且感官性能評價優(yōu)良，具有抑制皮膚油脂分泌、美白的功效。

4.5 抗高血壓

MLFs中的蘆丁和槲皮素等成分具有維生素P樣作用，可增強血管柔韌性，改善血管通透性，具有很好的擴冠作用，可起到抗高血壓作用。陳迎霞[35]開發(fā)了一種含MLFs的中藥湯劑，可用于治療由高血壓引起的頭暈，還可清熱去火，安全性較好。

4.6 其它作用

Thabti等[36]研究表明，MLFs能抵抗新冠病毒。Cai等[37]經(jīng)大鼠試驗，證實飼料中添加桑葉能使動物增重。Tomczyk等[38]發(fā)現(xiàn)桑葉能提高淀粉酶活性，豐富蜂蜜營養(yǎng)。研究[39-42]表明，MLFs能增強仔豬對疾病的抵抗力；改善牛的瘤胃環(huán)境，抵抗氧化，促進(jìn)水牛生長；提高雞蛋蛋黃的黃度；提高家禽消化和繁殖能力，促進(jìn)家禽生長，提升肉質(zhì)口感和營養(yǎng)。MLFs可能通過抑制脂氧合酶，改變前列腺素(PEG)的生物合成過程，進(jìn)而起到抗炎效果。此外，桑葉中的槲皮素、桑色素等具有抗病毒作用。

5 展望

MLFs含量較高，活性較好，且具有多種藥理學(xué)作用，因而對MLFs的研究已成為學(xué)者們關(guān)注的熱點之一。目前，關(guān)于MLFs的研究主要集中在MLFs的提取和分離純化方面，對于MLFs藥理學(xué)作用的研究也逐漸增多。今后，可以從以下幾個方面對MLFs開展進(jìn)一步研究：(1)將目前進(jìn)行的MLFs研究放大應(yīng)用于實際大規(guī)模生產(chǎn)中；(2)采用HPLC法等分離純化手段分離出MLFs單一組分，并研究單一組分的藥理學(xué)作用；(3)MLFs的抗氧化作用較強，可進(jìn)一步研究其體內(nèi)抗氧化作用；(4)進(jìn)一步研究MLFs的藥理學(xué)作用機制，以提高桑葉的利用價值；(5)拓寬MLFs的應(yīng)用范圍，研發(fā)相應(yīng)的食品、飲料、飼料添加劑、化妝品等；(6)研究影響MLFs含量的外在因素，設(shè)計更好的培育方法。

總之，桑葉作為一種天然產(chǎn)物，在具有高效的藥理學(xué)作用的同時，又具有安全、易大量培育和應(yīng)用廣泛等特點，使得MLFs具有廣闊的研究前景，對其研究會越來越深入和全面。