李寶志 李 鋒 樸永革 陳 明 佟亞楠
(吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心,吉林 長春 130031)
大果紫檀(Pterocarpus macrocarpusKurz)為蝶形花科紫檀屬植物,別名緬甸花梨、草花梨,是最常見的花梨木類木材之一,原產(chǎn)于緬甸、泰國、老撾、柬埔寨和越南[1-3]。其心材是制作實(shí)木家具、高端樂器、美工飾品等的優(yōu)選材料[4-5]。樹皮和根可以入藥,味辛、性溫、無毒[6-7],入脾、胃、肺經(jīng)。大果紫檀心材本身香氣濃郁,具有凝神和抗疲勞等作用,其含揮發(fā)油3%~5%,主要為萜烯、萜醇和類黃酮等多種活性成分,是貴重的藥材和名貴的香料[8-10]。大果紫檀心材在加工過程中,會(huì)產(chǎn)生大量的邊角料和刨花,未被有效利用,造成資源的浪費(fèi)。利用這些加工產(chǎn)生的邊角料和刨花提取大果紫檀揮發(fā)油,作為特色天然植物香原料使用,可提高其經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值[11-12]。
香料在刺激人類味覺和嗅覺神經(jīng)方面起到關(guān)鍵性的作用,已被廣泛應(yīng)用于食品、日化、煙草、醫(yī)藥等行業(yè)[13-14]。天然香料因其制備工藝不同而性狀不同,分為精油、凈油、浸膏、酊劑、油樹脂等[15-16]。目前,傳統(tǒng)的香料提取方法雖然多樣,但在提取時(shí)會(huì)對(duì)草本植物中有效成分和香氣品質(zhì)造成破壞,降低其有效成分的收率,同時(shí)增加生產(chǎn)成本[17-19]。因此,本文采用超臨界CO2萃取的方法提取大果紫檀揮發(fā)油成分,通過單因素試驗(yàn)探究萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間等因素對(duì)提取效果的影響,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了揮發(fā)油工藝條件,并以氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)大果紫檀揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定,研究成果對(duì)于充分挖掘利用天然香源植物資源優(yōu)勢(shì),研制開發(fā)新型特色天然植物香料具有重要意義。
大果紫檀(心材)切片,由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)(云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院)提供;CO2(食品級(jí)),純度≥99.9%,長春市氧氣廠;二氯甲烷為色譜純,德國Merck公司;水楊酸乙酯,純度≥98%,美國Sigma-Aldrich公司;無水硫酸鈉為分析純,北京化工廠。
超臨界CO2萃取儀(HA220-50-06 型),南通市華安超臨界萃取有限公司; LG-1 食品型真空冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技公司;多功能粉碎機(jī),上海兆申科技有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B/5977C),美國安捷倫公司;ML204T型電子分析天平,瑞士Mettler Toledo公司;超純水機(jī)(Milli-Qintegral 10),美國Millipore公司。
1.3.1 樣品制備
大果紫檀心材經(jīng)切片后,用食品型真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行低溫干燥,干燥12 h后,用多功能植物粉碎機(jī)粉碎,過80 目篩網(wǎng),即制得大果紫檀試樣。
1.3.2 超臨界萃取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用單因素試驗(yàn),對(duì)影響大果紫檀揮發(fā)油得率的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化和分析。稱取200 g大果紫檀粉末置于超臨界CO2萃取釜(1 L)中,在一定萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間下進(jìn)行提取,計(jì)算揮發(fā)油得率。
1.3.3 大果紫檀揮發(fā)油得率計(jì)算
式中:Y為揮發(fā)油得率,%;Mq為揮發(fā)油質(zhì)量,g;My為大果紫檀粉末質(zhì)量,g。
1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界萃取工藝條件
根據(jù)大果紫檀揮發(fā)油單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定萃取溫度(A)、萃取壓力(B)和萃取時(shí)間(C)為影響揮發(fā)油得率的3 個(gè)主要因素,運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)(Design-Expert8.0.6 軟件),以大果紫檀揮發(fā)油得率(Y)為響應(yīng)面值,取最優(yōu)異的水平組合進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)因素與水平見表 1。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels used in response surface design
1.3.5 大果紫檀揮發(fā)油的GC-MS分析[20]
稱取0.01 g大果紫檀揮發(fā)油于50 mL具塞三角瓶中,依次加入二氯甲烷萃取劑10 mL和50 μL水楊酸乙酯內(nèi)標(biāo)溶液(濃度為10 mg/mL),混合均勻后進(jìn)行無水硫酸鈉脫水處理,靜置至樣品分層,取下層溶液用0.45 μm微孔過濾膜過濾,備用。
采用氣質(zhì)聯(lián)用對(duì)萃取得到的大果紫檀揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)分析。GC-MS分析條件:Agilent HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);進(jìn)樣體積:1 μL;分流比:不分流;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;程序升溫:起始溫度50 ℃保持2 min,以8 ℃/min的速率,升至240 ℃保持2 min,再以10 ℃/min的速率,升到270 ℃保持8 min;電離方式:電子轟擊;電離能量:70 eV;傳輸線溫度:250 ℃;離子源溫度:230 ℃;掃描范圍:40~400 m/z;使用Nist和Wiley譜庫檢索。
2.1.1 萃取溫度對(duì)揮發(fā)油得率的影響
稱取200 g大果紫檀粉末置于超臨界CO2萃取釜中,萃取壓力25 MPa,萃取時(shí)間90 min,研究在35、40、45、50、55、60 ℃不同溫度下?lián)]發(fā)油提取率的變化,結(jié)果如圖1 所示。由圖可知,在相同萃取壓力和萃取時(shí)間條件下,大果紫檀揮發(fā)油得率隨著萃取溫度的升高先增加后減少。35~45 ℃時(shí),提取率隨著溫度的升高而快速增加;45~50 ℃時(shí),提取率的增加速度趨于平緩;50 ℃后,提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì),并且得到的揮發(fā)油色澤變深、性狀較差,可能是溫度升高,導(dǎo)致了某些香氣物質(zhì)和活性成分分解,同時(shí)心材中的色素、纖維和果膠等物質(zhì)也被提取出來,使得揮發(fā)油得率略有下降。因此,萃取溫度選擇50 ℃為宜。
圖1 萃取溫度對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig. 1 Effect of temperature on the extraction rate
2.1.2 萃取壓力對(duì)揮發(fā)油得率的影響
保持其他萃取條件一定,分別在15、20、25、30、35、40 MPa萃取壓力下進(jìn)行揮發(fā)油的提取,結(jié)果如圖2所示。從圖中可見,揮發(fā)油得率隨著壓力的升高呈先增加后下降的趨勢(shì)。在15~25 MPa時(shí),提取率隨著溫度的升高而急劇上升;在25~30 MPa時(shí),揮發(fā)油得率增加趨于緩和;壓力超過30 MPa后,揮發(fā)油得率隨著壓力的升高反而下降。因此,萃取壓力選擇25 MPa為宜。
圖2 萃取壓力對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig. 2 Effect of pressure on the extraction rate
2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響
保持其他萃取條件一定,在萃取時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 min條件下進(jìn)行揮發(fā)油提取試驗(yàn),結(jié)果如圖3 所示。由圖可見,當(dāng)萃取時(shí)間為90 min時(shí),揮發(fā)油提取率最高;90 min以后,提取率隨時(shí)間變化稍有下降。因此,綜合考慮,確定萃取時(shí)間選為90 min。
圖3 萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig. 3 Effect of time on the extraction rate
2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析[23-24]
響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案對(duì)表2 中的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合,得到大果紫檀揮發(fā)油得率對(duì)萃取溫度(A)、萃取壓力(B)和萃取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=3.84-0.100A+0.25B+0.028C-0.018AB-0.002 5AC+0.027BC-0.25A2-0.46B2-0.19C2。響應(yīng)值的影響程度可由回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)的大小來判斷,各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度與二次回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小成正比關(guān)系,系數(shù)的正、負(fù)反映了影響方向。從回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)可知,影響大果紫檀揮發(fā)油萃取因素的主次順序?yàn)椋狠腿毫?B)>萃取溫度(A)>萃取時(shí)間(C)。
表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken experimental design and results
2.2.2 回歸方程及方差分析
回歸方程的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表 3。
從表3 可知,回歸項(xiàng)中P值<0.01,說明所選擇模型差異極顯著。失擬項(xiàng)P值為0.348 9,此失擬項(xiàng)差異不顯著(P>0.05)。由此可知,該模型較顯著地?cái)M合了萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響,該模型所得的二次回歸方程可代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由此模型的決定系數(shù)R2Adj =0.959 6可知其具有較好的擬合程度,95.96 %的響應(yīng)值變化可通過該模型解釋,因此該模型極顯著且準(zhǔn)確,能夠很好地顯示大果紫檀揮發(fā)油的變化,較好地對(duì)揮發(fā)油得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表3 可知該二次回歸方程系數(shù)的顯著性,萃取溫度(A)、萃取壓力(B)、萃取溫度的二次項(xiàng)A2、萃取壓力的二次項(xiàng)B2、萃取時(shí)間的二次項(xiàng)C2對(duì)揮發(fā)油得率具有極顯著的影響;萃取時(shí)間(C)、萃取溫度與萃取壓力的交互項(xiàng)AB、萃取溫度與萃取時(shí)間的交互項(xiàng)AC、萃取壓力與萃取時(shí)間的交互項(xiàng)BC對(duì)揮發(fā)油得率影響不顯著。
表3 回歸模型方差分析表Tab.3 The analysis table of variance of regression model
2.2.3 響應(yīng)面與等高線分析[25-27]
按照回歸模型繪制響應(yīng)面和等高線圖,圖4~6 反映了萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間的相互效應(yīng)之間的關(guān)系。
圖4 萃取溫度與萃取壓力交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響Fig. 4 Interaction between extraction temperature and extraction pressure effects on the extraction rate of volatile oil
圖4 顯示了萃取時(shí)間位于中心水平時(shí),萃取溫度(A)和萃取壓力(B)的交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響。由圖4 可知,萃取溫度和萃取壓力對(duì)揮發(fā)油得率變化的影響較強(qiáng),萃取溫度變化對(duì)揮發(fā)油得率的影響較大,表現(xiàn)為響應(yīng)曲面圖形的坡度較陡和等高線較密;萃取壓力變化對(duì)揮發(fā)油得率的影響相對(duì)較弱,表現(xiàn)為響應(yīng)曲面圖形坡度較緩和等高線較稀疏。
圖5 顯示了萃取壓力位于中心水平時(shí),萃取溫度(A)和萃取時(shí)間(C)的交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響。由圖5 可知,萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率變化的影響較弱,響應(yīng)曲面坡度緩和;等高線趨于圓形,表明萃取溫度與萃取時(shí)間交互作用不顯著。
圖5 萃取溫度與萃取時(shí)間交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響Fig. 5 Interaction between extraction temperature and extraction time effects on the extraction rate of volatile oil
圖6 顯示了萃取溫度位于中心水平時(shí),萃取壓力(B)和萃取時(shí)間(C)的交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響。由圖6 可知,萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率變化的影響相對(duì)較弱,萃取壓力對(duì)揮發(fā)油得率影響相對(duì)較小,表現(xiàn)為響應(yīng)曲面坡度較緩,等高線較稀疏;萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率變化的影響較大,響應(yīng)曲面圖形的坡度較陡,等高線較密。
圖6 萃取壓力與萃取時(shí)間交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響Fig. 6 Interaction between extraction pressure and extraction time effects on the extraction rate of volatile oil
2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)分析
通過中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件,得到提取大果紫檀揮發(fā)油理想的工藝參數(shù)為萃取溫度48.94 ℃、萃取壓力26.40 MPa、萃取時(shí)間92.82 min,此時(shí)揮發(fā)油得率3.88%。考慮到試驗(yàn)的可操作性和可行性,以萃取溫度50 ℃,萃取壓力25 MPa,萃取時(shí)間90 min進(jìn)行3 次重復(fù)萃取試驗(yàn),測(cè)得得率為3.92%,與模型預(yù)測(cè)值較接近。因此,響應(yīng)面法優(yōu)化得到超臨界CO2萃取大果紫檀揮發(fā)油的工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠。
采用GC-MS對(duì)萃取的大果紫檀揮發(fā)油成分進(jìn)行分析,結(jié)果如表4 所示。由總離子流圖可知,大果紫檀揮發(fā)油中含有的化合物種類較多,通過利用Nist和Wiley譜庫檢索和人工質(zhì)譜分析2 種分析方法,綜合分析后共鑒定出22 種化學(xué)成分,主要成分為沉香螺醇、β-桉葉醇、7-(2-羥丙基)-1,4a-二甲基十氫萘-1-醇、桉油烯醇、3-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)烯丙醇、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基環(huán)丙基)-環(huán)己烯、高紫檀素、美迪紫檀素、紫檀素、3,9-二甲氧基-6H苯并呋喃[3,2-c][1]苯并吡喃等。
表4 大果紫檀揮發(fā)油成分的分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of volatile oil from Pterocarpus macrocarpus Kurz
本文采用超臨界CO2萃取大果紫檀揮發(fā)油成分,并通過單因素考察和響應(yīng)面試驗(yàn)確定適宜的提取工藝為萃取溫度50 ℃、萃取壓力25 MPa、萃取時(shí)間90 min,此時(shí)揮發(fā)油提取率為3.92%。所得回歸模型擬合程度較高。通過GC-MS鑒定得出,大果紫檀揮發(fā)油包含22 種化學(xué)成分,主要成分有沉香螺醇、β-桉葉醇、7-(2-羥丙基)-1,4a-二甲基十氫萘-1-醇、桉油烯醇、3-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)烯丙醇、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基環(huán)丙基)-環(huán)己烯、高紫檀素、美迪紫檀素、紫檀素、3,9-二甲氧基-6H苯并呋喃[3,2-c][1]苯并吡喃等。使用超臨界CO2萃取得到的大果紫檀揮發(fā)油味道獨(dú)特優(yōu)雅,木香、樹脂香和清香突出,且留香時(shí)間持久、綿延性好,在日化、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。