馬立超，李登科，張春濤，于 潔，魏鵬程，田志章，許 峰，吳若昕，邢立霞，田 楠*

1.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心天津工作站，天津市東麗區(qū)成林道319號(hào) 300163 2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733號(hào) 201315

在煙草調(diào)制、醇化及烘焙等加工過程中會(huì)發(fā)生Maillard反應(yīng)，其中葡萄糖與氨、氨基酸反應(yīng)生成的Amadori化合物，占到烤煙干質(zhì)量的1.5%～2.0%［1-3]。Amadori化合物在常溫下化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定、沒有氣味，但在烤煙加工、燃吸過程中裂解后會(huì)產(chǎn)生具有芳香氣味的小分子化合物，可改善吃味、柔和煙氣、增加烘烤香和甜香［4-5]。因此，分析其在烤煙中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)具有重要的意義。

Amadori化合物極性強(qiáng)、種類多、結(jié)構(gòu)相似且無強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，分析難度較大［6-7]。目前，國內(nèi)外對(duì)Amadori化合物的分析主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8]、高效液相色譜法［9]、離子交換色譜法［10]、高效陽離子色譜-質(zhì)譜法［11]、配體交換-掃描毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法［12]、分子印跡富集分離-質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳檢測(cè)法［13]，但這些方法存在需要衍生化、選擇性差和檢測(cè)通量低等缺點(diǎn)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）具有高靈敏度、高選擇性和高通量分析的優(yōu)勢(shì)，廣泛用于中草藥［14-15]、食品［16]、煙草［17-22]等復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析與研究，已逐漸成為檢測(cè)煙草中Amadori化合物的主要手段［6-7，20-22]，但采用該方法測(cè)定出的Amadori化合物與烤煙香型的關(guān)系研究則未見報(bào)道。因此，采用LC-MS/MS法對(duì)8種不同香型烤煙中11種Amadori化合物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，并結(jié)合主成分分析（PCA）、層次聚類熱力圖分析（Hierarchical clustering heat map analysis，HCHMA）及t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法，研究Amadori化合物與烤煙香型的關(guān)系，旨在為烤煙香型和產(chǎn)地分析、煙葉品質(zhì)評(píng)價(jià)、配方設(shè)計(jì)優(yōu)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

8種香型烤煙典型產(chǎn)區(qū)［23]（云南、貴州、福建、河南、重慶、湖南、山東、黑龍江）的2017年中部煙葉樣品，共計(jì)69個(gè)。

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、乙酸（>98%，北京百靈威科技有限公司）；鹽酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；葡糖胺（Glucosamine，98%，美國Alfa Aesar公司）；1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro，97%）、1-脫氧-1-L-谷氨酸-D-果糖（Fru-Glu，93%）、1-脫氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala，95%）、1-脫氧-1-L-纈氨酸-D-果糖（Fru-Val，95%）、1-脫氧-1-L-異亮氨酸-D-果糖（Fru-Ile，96%）、1-脫氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu，98%）、1-脫氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe，95%）、l-脫氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp，95%）（加拿大TRC公司）；1-脫氧-1-L-組氨酸-D-果糖（Fru-His，95%）、1-脫氧-1-L-絲氨酸-D-果糖（Fru-Ser，95%）（上海淘普生物科技有限公司）。

1260-6420高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；KQ-600DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；XS204電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler公司）；0.22μm有機(jī)針式過濾器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Z300離心機(jī)（德國Hermle公司）；Discovery?HS F5色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.0μm，美國Supelco公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量11種Amadori化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，用10%（體積比）乙腈水溶液配制成濃度均為500μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：移取Fru-Pro、Fru-Ala單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各2 000μL，移取其他9種Amadori化合物單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各400μL，混合后用10%乙腈水溶液定容至50 mL，得到濃度分別為20μg/mL（Fru-Pro、Fru-Ala）、4μg/mL（其他9種Amadori化合物）的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取上述的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液25、50、250、500、1 000、5 000μL于10 mL容量瓶中，用10%乙腈水溶液定容。所配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中Fru-Pro和Fru-Ala的濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、10.00μg/mL，其余9種化合物濃度為0.01、0.02、0.10、0.20、0.40、2.00μg/mL。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品前處理及分析

將烤煙樣品在30℃下干燥，直至可用手指捻碎，研磨后過425μm（40目）篩，裝入棕色廣口瓶中，混勻［24]。準(zhǔn)確稱取300 mg煙末樣品于50 mL具塞錐形瓶中，加入9 mL 70%（體積比）甲醇水［0.1%（體積比）HCl]溶液，240 W功率下超聲萃取25 min，3 500 r/min下離心15 min，取200μL上清液以10%乙腈水溶液定容至10 mL，過有機(jī)針式過濾器后進(jìn)行LC-MS/MS分析。分析條件：

色譜柱：Discovery?HS F5色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.0μm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相A：0.1%（體積比）甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%（體積比）甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～2 min 10%B，2～4 min 10%～100%B，4～7 min 100%B，7～9 min 100%～10%B，9～20 min 10%B；流速：0.3 mL/min。離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離模式：正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：4 000 V；碰撞氣：N2；霧化器壓力：206.85 kPa（30 psi）；干燥氣溫度：350℃，流速：11 L/min；碎裂電壓、碰撞電壓、碰撞池加速電壓如表1所示。

表1 11種Amadori化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式參數(shù)Tab.1 MRM parameters of 11 Amadori compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以各Amadori化合物準(zhǔn)確的［M+H]+（M代表Amadori化合物）峰為母離子，進(jìn)行MRM模式的二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化，重點(diǎn)優(yōu)化碎裂電壓、碰撞電壓和碰撞池加速電壓。選出豐度較高的二級(jí)碎片離子［M+H-H2O]+、［M+H-2H2O]+、［M+H-H2O-CO]+、［M+H-C5H10O5]+或［AA+H]+（AA代表氨基酸）作為定量離子和輔助定量離子［6]。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

五氟苯丙基鍵合固定相（PFP）色譜柱呈現(xiàn)出多重保留機(jī)制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性，可以增強(qiáng)對(duì)難分離化合物的分離效果［16]。使用Discovery?HS F5 PFP色譜柱，采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定烤煙中的11種Amadori化合物，實(shí)現(xiàn)了同分異構(gòu)體Fru-Ile與Fru-Leu的最佳分離，標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM譜圖如圖1所示。

2.2.2 流動(dòng)相體系的選擇

在ESI源正離子模式下，流動(dòng)相中加入甲酸有利于Amadori化合物的胺基質(zhì)子化，提高離子化效率［6-7]。首先，分別考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相體系對(duì)Amadori化合物的分離效果。結(jié)果表明，Amadori化合物在0.1%甲酸水溶液-乙腈體系中的分離效果更好。在此基礎(chǔ)上，考察了甲酸添加量的影響，比較了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.2%甲酸水溶液-乙腈、水-0.1%甲酸乙腈、水-0.2%甲酸乙腈、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈5種流動(dòng)相體系對(duì)Amadori化合物的分離效果。其中，第2和第5種流動(dòng)相體系對(duì)Amadori化合物的分離效果最好，質(zhì)譜響應(yīng)也最高。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動(dòng)相體系中，Amadori化合物的峰形與分離效果更佳，同分異構(gòu)體Fru-Ile與Fru-Leu的分離效果最優(yōu)（如圖1所示），原因可能是甲酸在混合流動(dòng)相中的比例保持恒定。后續(xù)研究中采用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動(dòng)相體系。

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1 萃取溶劑優(yōu)化

煙葉中Amadori化合物的提取常用水、甲醇、甲醇水溶液、酸性水溶液等溶劑［6-7,20-22]。首先比較了水、50%（體積比，下同）甲醇水溶液、30%甲醇水溶液、甲醇、70%甲醇水溶液的萃取效果，如圖2中條件1～5所示（Fru-Pro、Fru-Ala質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，對(duì)應(yīng)左縱坐標(biāo)軸，其他化合物對(duì)應(yīng)右縱坐標(biāo)軸，圖3情況相同），其中70%甲醇水溶液的萃取效果較好。

在70%甲醇水溶液中分別加入0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%鹽酸（均為體積比），能有效提高溶劑萃取效果，如圖2中條件6～8所示。原因可能是加入的酸與Amadori化合物的胺基部分反應(yīng)生成鹽，增大了Amadori化合物在萃取液中的溶解度。其中加入0.1%鹽酸萃取效果最好，可能是因?yàn)辂}酸的酸性最強(qiáng)。

2.3.2 萃取時(shí)間

比較了不同萃取時(shí)間對(duì)11種Amadori化合物萃取量的影響。分別萃取10、15、20、25、30 min的結(jié)果（圖3）表明，25 min時(shí)已基本萃取完全，繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，萃取量提高不明顯。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

在LC-MS/MS中，基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）對(duì)檢測(cè)結(jié)果可靠性和準(zhǔn)確性的影響不容忽視。補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有基質(zhì)凈化法、同位素標(biāo)記法、基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法、稀釋法等［25-26]。本研究中采用稀釋法進(jìn)行校準(zhǔn)來消除基質(zhì)效應(yīng)，取1 mL 1.2.2節(jié)離心后的萃取液（稀釋因子?取1）分別用10%乙腈水溶液稀釋定容至20、50、100、200 mL（?分別取20、50、100、200），得到4種不同稀釋因子的基質(zhì)溶液［26-27]。以稀釋的基質(zhì)溶液為溶劑，配制得到0.10μg/mL的4個(gè)稀釋因子下的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)；以10%乙腈水溶液為溶劑，配制得到0.10μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)；每個(gè)濃度點(diǎn)平行配制3組?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式：

式中：A和B分別表示基質(zhì)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的峰面積。

ME>0時(shí)，表示基質(zhì)對(duì)待測(cè)物有增強(qiáng)效應(yīng)；ME<0時(shí)，表示基質(zhì)對(duì)待測(cè)物有抑制效應(yīng)。|ME|≤20%，可認(rèn)為該基質(zhì)效應(yīng)微弱；20%＜|ME|≤50%，表示基質(zhì)效應(yīng)中等；若|ME|>50%，則表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)［25，28]。本研究中基質(zhì)對(duì)10種Amadori化合物表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，僅對(duì)Fru-Trp表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

結(jié)果（表2）表明：?取20時(shí)，|ME|≤15.7%；?取50倍及以上時(shí)，|ME|≤10.1%，在2.5.2節(jié)中通過回收率進(jìn)一步考察基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果均在可接受的范圍內(nèi)。綜合考慮目標(biāo)化合物響應(yīng)情況及基質(zhì)效應(yīng)，最終選取?=50。

表2 不同稀釋因子下基質(zhì)溶液的基質(zhì)效應(yīng)（|ME|）（n=3）Tab.2 Matrix effect（|ME|）of matrix solution with different dilution factors（n=3）

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 工作曲線和檢測(cè)限

對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。對(duì)低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后進(jìn)行測(cè)定，分別以3倍和10倍信噪比作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。由表3可知：方法的線性關(guān)系良好（r＞0.995），檢出限低（1.0～10.0 ng/mL），可用于烤煙中11種Amadori化合物的同時(shí)測(cè)定。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Tab.3 Linear equations,correlation coefficients,linear ranges,LODs and LOQs

2.5.2 回收率和精密度

對(duì)已知Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的烤煙樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定目標(biāo)物在低、中、高3個(gè)水平下的回收率。如表4所示，各目標(biāo)物的回收率在87.8%～110.2%之間，說明本方法較可靠。

表4 加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間精密度（n=6）Tab.4 Standard recoveries,intra-and inter-day RSDs（n=6）

將烤煙樣品按1.2節(jié)中的方法進(jìn)行處理和檢測(cè)，每天測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定6 d，考察方法的精密度（RSD）。如表4所示，日內(nèi)和日間RSD分別在1.1%～4.8%和2.9%～9.6%之間，說明方法的精密度和穩(wěn)定性較好。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

8種不同香型烤煙69個(gè)樣品的定量分析結(jié)果見表5。從Amadori化合物總量上看，清甜香型（云南）烤煙中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；蜜甜香型（貴州）、木香蜜甜香型（黑龍江）和焦甜醇甜香型（湖南）烤煙次之，醇甜香型（重慶）、蜜甜焦香型（山東）烤煙中等，清甜蜜甜香型（福建）、焦甜焦香型（河南）烤煙較低。清甜香型烤煙中還原糖和氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高［23]，因而Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；清甜蜜甜香型烤煙中氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低、焦甜焦香型烤煙中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低［23]，分別導(dǎo)致了各自Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低。此外，Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)還與煙草加工工藝及不同Amadori化合物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等密切相關(guān)［21,29-30]。

表5 烤煙樣品中11種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Tab.5 Contents of 11 Amadori compounds in flue-cured tobacco samples（Means±SD） （μg·g-1）

2.7 主成分分析

將得到的Amadori化合物數(shù)據(jù)采用R語言Princomp程序包進(jìn)行主成分分析［31-32]，KMO和Bartlett’s球形檢驗(yàn)結(jié)果：KMO=0.689（＞0.5），Bartlett’s球形檢驗(yàn)Sig.=0.000（＜0.05），適合進(jìn)行主成分分析［33-34]。PC1獨(dú)立貢獻(xiàn)率為37.82%，主要 反 映 來 自Fru-His（0.790）、Fru-Glu（0.813）、Fru-Leu（-0.759）、Fru-Ile（-0.736）、Fru-Trp（0.694）的信息；PC2獨(dú)立貢獻(xiàn)率為22.18%，主要反映的是來 自Fru-Pro（0.804）、Fru-Ala（0.657）、Fru-Phe（-0.718）、Fru-Ser（0.566）的信息；PC3獨(dú)立貢獻(xiàn)率為12.99%，主要反映的是來自Fru-Ile（0.528）、Fru-Val（0.503）、Fru-Glu（0.438）、Fru-His（0.396）的信息，累計(jì)貢獻(xiàn)率72.99%。上述結(jié)果表明，通過PCA所提取的主成分能夠代表8種不同香型烤煙中的Amadori化合物的主要信息。

PCA得分如圖4所示，Amadori化合物對(duì)烤煙香型的分類具有重要作用：不同香型烤煙分類效果較好，能清晰地反映不同香型烤煙特征。PCA得分圖中部分產(chǎn)區(qū)烤煙香型較為分散，可能是同一大產(chǎn)區(qū)下烤煙種植較為分散，導(dǎo)致不同小產(chǎn)區(qū)可能分屬于不同香型，如以蜜甜香型為特色的貴州產(chǎn)區(qū)，畢節(jié)西部、黔西南西部、六盤水西部烤煙屬于清甜香型，與云南東部烤煙品質(zhì)極為接近；以焦甜醇甜香型為代表的湖南產(chǎn)區(qū)，湘西、張家界、懷化、常德等地的烤煙則屬于醇甜香型，與重慶產(chǎn)區(qū)烤煙品質(zhì)極為接近；以焦甜焦香型為特色的河南產(chǎn)區(qū)，烤煙種植較為分散，包括許昌、平頂山、駐馬店、南陽、洛陽、三門峽等地，因而在PCA得分圖上較為分散［23]。

2.8 層次聚類熱力圖分析

將得到的Amadori化合物數(shù)據(jù)采用R語言Pheatmap程序包進(jìn)行分析，Z-Score數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，采用組間連接法，以歐氏距離為指標(biāo)進(jìn)行層次聚類熱力圖分析［31-32]，如圖5所示。

熱力圖中紅色表示Z-Score得分較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，藍(lán)色表示Z-Score得分較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低。清甜蜜甜香型烤煙中Fru-Val、Fru-Leu、Fru-Ile質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高；蜜甜焦香型、焦甜焦香型烤煙中Fru-Phe、Glucosamine質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高；清甜香型烤煙中Fru-Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高；蜜甜香型烤煙中Fru-Glu、Fru-Ser、Fru-His質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高；焦甜醇甜香型烤煙中Fru-Ala、Glucosamine質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高；醇甜香型烤煙中各Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)中等；木香蜜甜香型烤煙中Fru-Pro、Fru-Ala和Fru-Phe的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高。

HCHMA將69個(gè)烤煙樣品分為8大類；第Ⅰ類是S22～S30號(hào)樣品（產(chǎn)區(qū)福建，清甜蜜甜香型）；第Ⅱ類是S31～S38和S40號(hào)樣品（產(chǎn)區(qū)河南，焦甜焦香型），同樣產(chǎn)自河南的S39、S41號(hào)樣品歸入第Ⅲ類，可能是因?yàn)楹幽?、山東產(chǎn)區(qū)生態(tài)氣候較為接近；第Ⅲ類是S55～S60號(hào)樣品（產(chǎn)區(qū)山東，蜜甜焦香型）；第Ⅳ類是S13～S21號(hào)（除S14號(hào)）樣品（產(chǎn)區(qū)貴州，蜜甜香型），S14號(hào)樣品中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，歸入第Ⅴ類；第Ⅴ類是S1～S12號(hào)（除S8號(hào)）樣品（產(chǎn)區(qū)云南，清甜香型），Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，S8號(hào)樣品歸入第Ⅳ類；第Ⅵ類是S42～S47號(hào)樣品（產(chǎn)區(qū)重慶，醇甜香型），Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)居中；第Ⅶ類是S49～S54號(hào)（產(chǎn)區(qū)湖南，焦甜醇甜香型），S48號(hào)樣品可能來自于湘西北產(chǎn)區(qū)（湘西、張家界、懷化、常德等地），列入第Ⅵ類；第Ⅷ類是黑龍江產(chǎn)區(qū)（木香蜜甜香型），樣品中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。與烤煙樣品的原香型、產(chǎn)地進(jìn)行對(duì)比，其分類準(zhǔn)確率達(dá)到91.3%，說明根據(jù)Amadori化合物測(cè)定結(jié)果結(jié)合層次聚類熱力圖分析可以對(duì)烤煙香型進(jìn)行較好分類。

2.9 t分布隨機(jī)鄰域嵌入

t-SNE是一種用于探索高維數(shù)據(jù)的非線性降維流形學(xué)習(xí)算法，核心思想是用概率分布代替歐式距離來度量樣本數(shù)據(jù)間的相似性，使其在高維空間和低維空間的概率分布無限接近，相似對(duì)象有更高的概率被選擇而聚集在一起，最終將多維數(shù)據(jù)降低至二維或三維，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化展示［31，35]。流形學(xué)習(xí)算法拓展了傳統(tǒng)多元統(tǒng)計(jì)分析方法的范疇，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

將得到的Amadori化合物數(shù)據(jù)采用R語言Rtsne程序包進(jìn)行t-SNE分析［31-32]，結(jié)果如圖6所示：同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)較為集中，類內(nèi)散度遠(yuǎn)小于PCA結(jié)果，分類效果更具優(yōu)勢(shì)。Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的產(chǎn)區(qū)聚集在圖6上部，其中云南、貴州處于右上部，黑龍江、湖南處于左上部，重慶居中；質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的產(chǎn)區(qū)（河南、山東、福建）聚集在圖6的右下部；達(dá)到了“同類相近，異類相遠(yuǎn)”的效果。湖南產(chǎn)區(qū)的煙葉種植地區(qū)較分散，烤煙香型不同，有一個(gè)樣本落入重慶產(chǎn)區(qū)，推測(cè)其產(chǎn)地可能為湘西北地區(qū)（湘西、張家界、懷化、常德等地）［23]。

3 結(jié)論

①建立了烤煙中11種Amadori化合物的LC-MS/MS分析方法。本方法的LODs為1.0～10.0 ng/mL，日內(nèi)、日間RSDs分別為1.1%～4.8%和2.9%～9.6%（n=6），回收率為87.8%～110.2%，基質(zhì)效應(yīng)|ME|≤10.1%（?≥50）。②結(jié)合PCA、HCHMA及t-SNE等多元統(tǒng)計(jì)分析方法，研究Amadori化合物與烤煙香型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同香型烤煙具有明顯的分類趨勢(shì)，69個(gè)樣品可劃分為8類，t-SNE分析的區(qū)分效果更明顯，HCHMA結(jié)果中香型與產(chǎn)地的對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確率達(dá)91.3%。③Amadori化合物測(cè)定結(jié)果結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可為烤煙香型和產(chǎn)地分析、煙葉品質(zhì)評(píng)價(jià)、配方設(shè)計(jì)優(yōu)化提供技術(shù)支持。