吳興富，焦芳嬋，馮智宇，陳學軍，張光海，李永平

云南省煙草農業(yè)科學研究院，昆明市五華區(qū)圓通街33號 650021

煙草種質資源是新品種選育的材料基礎，種質資源遺傳多樣性可反映其遺傳背景、育種潛力和利用價值，遺傳多樣性研究對發(fā)掘利用資源、親本選擇、拓寬育成品種遺傳基礎和保護優(yōu)異種質具有重要意義［1]。在煙草種質資源遺傳多樣性研究方面，基于分子標記的遺傳多樣性研究報道較多［2-5]，表型遺傳多樣性研究報道較少［5-7]，但這些研究未涉及煙葉物理特性。烤煙物理特性作為煙葉品質的重要組成部分，其中含梗率、填充值和平衡含水率等是卷煙加工性能的重要指標，直接影響卷煙加工工藝、產品風格、成本及經濟效益［8]。目前，烤煙物理特性相關研究主要集中在不同品種煙葉物理特性差異［9-10]、特定產區(qū)煙葉物理特性［11-12]以及物理特性與煙葉外觀品質［13-14]、化學成分含量（質量分數）［15-18]、感官品質［19-20]的關系等方面。楊虹琦等［10]研究表明，同一栽培條件下不同烤煙品種煙葉含梗率存在顯著差異;尹啟生等［11]研究提出了我國烤煙中部葉的葉面密度、拉力、填充值、平衡含水率、含梗率、單葉質量等物理特性指標的范圍；付秋娟等［13]研究提出烤煙物理特性與外觀品質關系密切。王建民等［18]試驗認為，填充值、葉面密度與總糖和還原糖呈負相關，平衡含水率與總植物堿呈負相關，填充值與總氮和氯量呈正相關，葉面密度與總植物堿和總氮呈正相關，平衡含水率與總糖和還原糖呈正相關;劉陽等［20]研究表明，在較適宜范圍內的單葉質量、含梗率與感官品質顯著相關。但有關烤煙種質資源物理特性的遺傳多樣性研究尚鮮見報道。為此，采用檢測遺傳變異最傳統(tǒng)和直觀的表型性狀研究方法［21]，對269份烤煙資源C3F煙葉的6個物理特性指標的表型進行遺傳多樣性分析和R語言聚類分析，以期為烤煙物理特性優(yōu)異的種質篩選、育種親本選擇以及品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

2018年在云南石林板橋種植269份烤煙種質資源，包括129份國內種質資源（編號1～129），140份國外種質資源（編號130～269）。其中美國種質資源102份（編號130～231）、其他來源種質資源38份（編號232～269）。每份種質資源種植50株，采用膜下小苗移栽，行距120 cm，株距50 cm，田間管理按當地優(yōu)質煙葉生產技術規(guī)范操作。大田煙株中心花開放時打頂，煙葉適熟采收，采用烤煙生產中最常用的密集烤房（氣流下降式）和三段式烘烤工藝對參試煙葉進行烘烤。煙葉烘烤結束后，每份種質資源取C3F煙葉2 kg，用于物理特性指標的測定。

1.2 物理特性指標檢測

按照YQ-YS/T 1—2018標準方法［22]，測定參試種質資源C3F煙葉的葉面密度、單葉質量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值。

1.3 數據處理

利用Excel計算參試種質資源6個物理特性指標的最大值、最小值、極差、平均值、標準差和變異系數（CV）。參照王繼師等［23]的方法，將每個指標劃分為10級，從第1級＜X-2S到第10級≥X+2S，中間隔0.5S為1級。X為平均值，S為標準差，計算各指標每一級的相對頻率，然后按照公式（1）計算Shannon-Weaver遺傳多樣性指數（H′），并用各指標多樣性指數的平均值表示一類或所有種質資源的遺傳多樣性程度。

按YQ-YS/T 1—2018標準［22]中的西南煙區(qū)烤煙物理特性指標評分賦值法（見表1），利用公式（2）計算參試種質資源物理特性指標分值［18]。

計算公式：

式中：H′為Shannon-Weaver遺傳多樣性指數；Pi為某指標第i級的頻率；ln為自然對數。

式中：G為物理特性分值；Fi為第i個物理特性指標的量化分值，各個指標的量化分值由表1計算得出；Hi為第i個物理特性指標的權重，葉面密度、單葉質量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的權重分別為0.14、0.20、0.21、0.08、0.17和0.20。

為便于描述，根據表1評分賦值，將物理特性指標適宜性劃分為4檔，即評分賦值100、100～80、80～60、＜60的適宜性依次為最適宜、適宜、次適宜和不適宜，葉面密度、單葉質量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的最適宜范圍分別為70.0～75.0 g/m2、9.0～11.0 g、1.8～2.0 N、≥13.5%、≤25.0%、≥4.3 cm3/g，適宜范圍分別為60.0～70.0 g/m2或75.0～85.0 g/m2、7.0～9.0 g或11.0～13.0 g、1.4～1.8 N或2.0～2.4 N、12.0%～13.5%、25.0%～31.0%、3.9～4.3 cm3/g，各指標次適宜和不適宜的范圍依此類推。

表1 烤煙物理特性指標評分賦值（西南煙區(qū)）Tab.1 Assignment for physical characteristic indexes of flue-cured tobacco from southwest tobacco growing areas

利用R語言軟件，對269份種質資源6個物理特性指標進行數據標準化處理，用皮爾遜相關系數距離法（Pearson correlation distance）計算距離，然后用平均值進行層次聚類。同時，采用完全隨機分析方法，對不同類別種質資源和聚類分析的6個物理特性指標和二級統(tǒng)計指標均值進行差異顯著性檢驗（新復極差法）。

2 結果與分析

2.1 參試種質資源物理特性指標描述性統(tǒng)計及頻率分布

參試種質資源6個物理特性指標統(tǒng)計結果（表2）表明，變異系數以填充值最大（20.25%），平衡含水率最?。?.73%），平均為15.88%，說明物理特性指標差異較大。6個指標的遺傳多樣性指數以含梗率最大（2.050），填充值最?。?.934），平均為2.014，說明物理特性遺傳多樣性較豐富。同時，從各指標均值適宜性（表2）來看，平衡含水率（17.0%）最適宜（＞13.5%），填充值（3.2 cm3/g）不適宜（＜3.4 cm3/g），葉面密度（83.8 g/m2）、單葉質量（12.5 g）、拉力（2.1 N）和含梗率（28.7%）適宜。

表2 參試種質資源的物理特性描述性統(tǒng)計及遺傳多樣性分析Tab.2 Descriptive statistics and genetic diversity analysis of physical characteristic of experimental germplasm resources

從6個物理特性指標基于10級分類的頻率分布（圖1）來看，6個指標并非平均分布，而是在不同數值范圍內具有一定的集中性，葉面密度、單葉質量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的集中分布范圍分別為67.5～92.0 g/m2、10.2～13.7 g、2.1～2.5 N、16.5%～18.2%、24.3%～33.1%和2.6～3.5 cm3/g，分布頻率依次為56.9%、62.8%、57.6%、60.6%、71.0%和65.1%。從物理特性指標適宜性來看，參試種質資源葉面密度、單葉質量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值最適宜范圍分布頻率分別為11.5%（31份）、18.6%（50份）、20.1%（54份）、99.3%（267份）、20.1%（54份）和9.7%（26份）。可見，參試種質資源中平衡含水率優(yōu)異的種質資源豐富，填充值和葉面密度優(yōu)異的種質資源相對匱乏，單葉質量、拉力和含梗率優(yōu)異的種質資源較豐富。

2.2 參試種質資源物理特性的遺傳多樣性分析

從不同來源種質資源（表3）來看，除單葉質量外，其他5個指標及物理特性分值的差異達到顯著或極顯著水平，國內種質資源的拉力大于其他種質資源，含梗率高于美國種質資源，填充值大于美國種質資源，物理特性分值高于美國種質資源，葉面密度小于美國和其他種質資源，平衡含水率低于美國種質資源。美國種質資源的平衡含水率比其他種質資源稍高，含梗率低于其他種質資源，填充值小于其他種質資源，物理特性分值略低于其他種質資源。從遺傳多樣性指數看，國內種質資源中拉力、平衡含水率和填充值的H′略高于美國種質資源，葉面密度的H′略低于美國種質資源，單葉質量、平衡含水率的H′略高于其他種質資源，填充值的H′略低于其他種質資源。美國種質資源葉面密度、單葉質量和含梗率的H′略高于其他種質資源，拉力和填充值的H′略低于其他種質資源。國內種質資源物理特性分值的H′（2.049）略高于美國種質資源（1.956）和其他種質資源（2.000），6個物理特性指標的平均H′（1.979）略高于美國種質資源（1.956）和其他種質資源（1.932）?？梢姡瑖鴥确N質資源物理特性指標的遺傳多樣性比國外種質資源稍豐富。

表3 不同來源種質資源的物理特性遺傳多樣性①Tab.3 Genetic diversity of physical characteristics of germplasm resources from different sources

2.3 國內地方和雜交選育種質資源的物理特性遺傳多樣性差異分析

國內種質資源來源明確的72份地方種質資源和40份雜交選育種質資源的物理特性指標見表4。方差分析結果表明，地方種質資源和雜交選育種質資源的各物理特性指標間差異未達到顯著水平。從H′來看，地方種質資源的葉面密度、單葉質量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的H′明顯高于雜交選育的種質資源，同時，這6個指標的平均H′和物理特性指標分值H′亦高于雜交選育的種質資源，表明國內地方種質資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質資源物理特性的遺傳多樣性豐富，在品種選育或改良中具有較好應用前景。

表4 國內地方和雜交選育種質資源物理特性的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of physical characteristics of domestic local germplasm resources and hybrid breeding germplasm resources

2.4 參試種質資源物理特性指標聚類分析

利用R語言軟件對269份烤煙種質資源6個物理特性指標進行層次聚類，在相似距離0.982處，可將參試種質資源聚為4個類群（圖2），Ⅰ類群包括053、034等73份種質資源，Ⅱ類群包括222、264等70份資種質源，Ⅲ類群包括114、248等94份種質資源，Ⅳ類群包括168、173等32份種質資源，各類群種質資源物理特性主要參數見表5。從表5可見，類群間6個聚類指標和二級統(tǒng)計指標物理特性分值的差異達極顯著水平。從物理特性指標適宜性來看，4個類群種質資源的平衡含水率均在最適宜范圍，其他指標的適宜性在類群間存在差異，Ⅰ類群葉面密度、單葉質量、拉力、含梗率適宜，填充值次適宜。Ⅱ類群拉力最適宜，葉面密度、單葉質量適宜，含梗率、填充值次適宜。Ⅲ類群單葉質量、拉力、含梗率適宜，葉面密度和填充值不適宜。Ⅳ類群拉力最適宜，含梗率適宜，葉面密度次適宜，單葉質量、填充值不適宜。

表5 不同類群種質資源物理特性指標的差異分析Tab.5 Difference analysis of physical characteristic indexes of germplasm resources in various groups

物理特性分值是衡量煙葉物理特性好壞的重要指標，分值越大，煙葉物理特性越好［22]。Ⅰ類群、Ⅱ類群種質資源物理特性分值高于Ⅲ類群、Ⅳ類群，表明Ⅰ類群、Ⅱ類群種質資源的物理特性優(yōu)于Ⅲ類群、Ⅳ類群。對物理特性具體指標而言，含梗率越低越好，平衡含水率和填充值越大越好，葉面密度、單葉質量和拉力均在適宜性范圍內，煙葉物理特性指標間存在復雜的相互關系。因此，在評價烤煙種質資源物理特性時，除物理特性分值外，各指標的適宜性也應給予關注。進一步分析表明，269份參試種質資源中，92份種質資源物理特性分值達80分以上，其聚在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群的種質資源數分別為33份、47份、8份和4份，其中12份物理特性分值90分以上的種質資源聚在Ⅰ類群（7份）和Ⅱ類群（5份），這12份種質資源的主要物理特性參數見表6。福泉厚節(jié)巴和薄荷煙的葉面密度、金黃柳的單葉質量、索馬里2號的含梗率次適宜，日本烤煙2的含梗率不適宜，這5份種質資源物理特性分值高，但個別指標適宜性存在欠缺。豐字6號、黃苗榆、B22、革新6號、牡單81-56、黑玉米棒子和鳳城黃金等7份種質資源物理特性分值高，6個指標均在最適宜或適宜范圍，這7份物理特性優(yōu)異的種質資源可在品種選育或物理特性改良中根據育種目標選擇利用。

表6 12份烤煙種質資源的物理特性指標比較Tab.6 Analysis of physical characteristic indexes of 12 flue-cured tobacco germplasm resources

3 討論

269份參試種質資源物理特性指標頻率分布和適宜性分布表明，平衡含水率優(yōu)異的種質資源豐富，填充值、葉面密度優(yōu)異的種質資源相對匱乏，單葉質量、拉力、含梗率優(yōu)異的種質資源較豐富，在烤煙種質資源研究中，應加強填充值和葉面密度優(yōu)異的種質資源的收集鑒定。參試種質資源6個物理特性指標變異系數6.73%～20.25%，遺傳多樣性指數1.934～2.050、平均2.014，遺傳多樣性較豐富。同時，煙葉平衡含水率變異系數最低（小于10%），這與劉陽等［20]和李瑞麗等［24]研究結果一致。但有關平衡含水率變異系數低的原因還有待進一步研究。

遺傳多樣性通常指種內不同群體之間或一個群體內不同個體的遺傳變異總和，種內遺傳變異越豐富，對環(huán)境的適應能力越強，其物種進化的潛力越大。本試驗中國內種質資源物理特性遺傳多樣性比國外資源稍豐富，國內地方種質資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質資源豐富。國內種質資源物理特性遺傳多樣性比國外資源稍豐富的原因，可能與煙草傳入我國后不同生態(tài)環(huán)境的長期馴化和非目標多樣化選擇等有關。煙草傳入我國已有400多年，在長期的種植過程中，資源間的天然雜交、自然突變，以及不同種植區(qū)域農民根據自己需求（如抗逆性好）進行了選擇等，這種長期的環(huán)境馴化和非目標多樣化選擇豐富了國內種質資源的遺傳多樣性。國內地方種質資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質資源豐富的原因，與長期人為定向選擇和保守的育種策略有關。煙草作為特殊的葉用經濟作物，圍繞“優(yōu)質、抗病”進行育種選擇，長期的人為定向選擇導致煙草育種過度依賴骨干親本，且親本種質資源遺傳背景狹窄［25-26]，進而導致雜交選育品種遺傳多樣性降低。美國煙草育種也存在類似情況，為通過最低育種標準，煙草新品種選育基本是核心種質間的雜交，美國20世紀40年代以前的37個農家品種遺傳相似系數為0.758，20世紀90年代和21世紀前10年育成品種的遺傳相似系數分別為0.849和0.874，與農家品種相比，雜交選育品種遺傳多樣性變低，遺傳基礎變窄［27]?？梢姡L期的人為定向選擇和保守的育種策略是導致雜交選育品種（或種質資源）遺傳多樣性降低的主要原因。

烤煙物理特性受煙區(qū)生態(tài)環(huán)境［11-12]和烘烤過程［28]的影響，對本試驗中7份烤煙物理特性優(yōu)異種質資源進行選擇利用時，要綜合分析煙區(qū)生態(tài)環(huán)境、烤房類型及烘烤工藝等與本試驗條件的相似性，必要時可對其在當地的物理特性表現(xiàn)進行驗證后再選擇利用。因此參試種質資源在不同生態(tài)區(qū)域和不同烘烤條件下的物理特性的差異還有待進一步研究。

4 結論

269份烤煙種質資源物理特性遺傳多樣性較豐富，平衡含水率指標優(yōu)異的種質資源豐富，填充值和葉面密度指標優(yōu)異的種質資源相對匱乏，單葉質量、拉力和含梗率指標優(yōu)異的種質資源較豐富。國內種質資源物理特性遺傳多樣性比國外種質資源稍豐富，國內地方種質資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質資源豐富。豐字6號、黃苗榆、B22、革新6號、牡單81-56、黑玉米棒子和鳳城黃金等7份烤煙物理特性指標優(yōu)異的種質資源可供品種選育或物理特性改良時加以利用。