鄭澤洋，林丹*，張家意，朱惠綿，黃敏豐，丘韶麟，周英雅，陳乘

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.食品企業(yè)質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)示范中心，廣東 廣州 511442；3.珠海市香洲區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，廣東 珠海 519000）

氯霉素（Chloramphenicol,CAP）是一種廣譜抗生素，其效高價(jià)廉，曾在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣為應(yīng)用?？股氐氖褂貌粌H給海洋環(huán)境帶來不利影響，包括抑制沉積物中有益微生物的活性，影響生物地球化學(xué)循環(huán)，且長(zhǎng)期使用會(huì)引起病原生物的抗藥性增強(qiáng)和水生生物體藥物殘留等問題[1]。我國(guó)自2002年起已明確禁止氯霉素及其鹽、酯添加或用于所有食品動(dòng)物中，規(guī)定在所有動(dòng)物可食部分中不得檢出[2]。但近年來在各省市的食品安全監(jiān)督抽查中，頻繁在水產(chǎn)品中檢出氯霉素，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的健康。

食品快速檢測(cè)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)，已廣泛用于食品安全監(jiān)管中[3]。膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatography assay,GICA）是常用的快速檢測(cè)方法之一，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，膠體金免疫層析法已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留初篩，能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)幾十甚至上百個(gè)樣品，并且不需用到復(fù)雜儀器設(shè)備，樣品處理簡(jiǎn)單。與傳統(tǒng)的儀器法相比，膠體金免疫層析法具有快速、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。劉文珍等[4]應(yīng)用膠體金免疫層析法快速檢測(cè)9種水產(chǎn)品中殘留的氯霉素，表明方法具有良好的穩(wěn)定性，特異性較好，與國(guó)標(biāo)方法相比，試驗(yàn)結(jié)果基本一致。王媛等[5]分析比較了3種測(cè)定水產(chǎn)品中氯霉素殘留的商品化膠體金快速檢測(cè)產(chǎn)品，其靈敏度、精密度、符合性和穩(wěn)定性均能滿足目前對(duì)氯霉素監(jiān)控的限量要求，適合水產(chǎn)品中氯霉素殘留的現(xiàn)場(chǎng)篩選。

現(xiàn)以膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法作為檢測(cè)手段，以菲律賓蛤仔為試驗(yàn)對(duì)象，探究其氯霉素殘留變化規(guī)律，為推進(jìn)快速檢測(cè)方法在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用提供參考，也為提高消費(fèi)者的貝類食用安全提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試劑與樣品

氯霉素（CAS號(hào)：56-75-7）純度為99%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；氯霉素殘留檢測(cè)試紙條，購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司；菲律賓蛤仔由廣州市某市場(chǎng)購(gòu)得。

1.2 靈敏度與精密度試驗(yàn)

（1）靈敏度。對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，該氯霉素試劑盒產(chǎn)品檢出限為0.1μg/kg。采用空白菲律賓蛤仔樣品添加0.1、0.5和1μg/kg CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做6次平行。

（2）精密度。采用空白菲律賓蛤仔樣品添加0.1μg/kg CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用同一批號(hào)的產(chǎn)品在同一時(shí)間測(cè)定10次，判斷產(chǎn)品的精密度。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）停藥處理。將菲律賓蛤仔分別暫養(yǎng)于低中高3個(gè)質(zhì)量濃度（0.25，1.5，5 mg/L）的CAP溶液中；4 h后置于海水中暫養(yǎng)24 h，并于第1，3，6，9，12，18和24 h取樣；采用膠體金免疫層析法測(cè)定其CAP殘留。

（2）換水處理。將菲律賓蛤仔暫養(yǎng)于5 mg/L的CAP溶液中，暫養(yǎng)4 h；停藥后，在海水暫養(yǎng)24 h內(nèi)，每1、3和6 h換一次水，并于第1，3，6，9，12，18和24 h取樣；采用膠體金免疫層析法測(cè)定其CAP殘留。

（3）換水和預(yù)煮協(xié)同處理。將菲律賓蛤仔暫養(yǎng)于5 mg/L的CAP溶液中，暫養(yǎng)4 h。停藥后，在海水暫養(yǎng)24 h內(nèi)，每1，3，6 h換一次水，并于第1，3，6，9，12，18和24 h取樣，在沸水中處理10 min，采用膠體金免疫層析法測(cè)定菲律賓蛤仔中CAP殘留情況。

1.4 樣品處理

參考氯霉素殘留檢測(cè)試紙條說明書方法，取5~10個(gè)菲律賓蛤仔，去殼，勻漿。稱取（2.00±0.02）g勻漿好的組織樣本至10 mL聚苯乙烯離心管中，加入4 mL提取劑，渦旋混勻，劇烈震蕩約2 min后，3 000 r/min離心5 min；移取3 mL上層有機(jī)相至10 mL聚苯乙烯離心管中，于50~60℃水浴氮?dú)饬骰蚩諝饬飨麓蹈?；加入樣本?fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng)20 s后待檢。

1.5 樣品測(cè)定

取出試紙條回溫至室溫（即開即用），置于平整的臺(tái)面上。吸取1.4中待測(cè)樣本溶液75μL垂直滴加于加樣孔中，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，在10 min內(nèi)讀取結(jié)果。以磷酸鹽緩沖液代替樣品提取液作為空白進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.6 結(jié)果判定

參考氯霉素殘留檢測(cè)試紙條說明書結(jié)果判定方法。

（1）試劑板有效性判定。如果空白對(duì)照控制線（以下簡(jiǎn)稱C線）沒有出現(xiàn)紅色條帶，見圖1（c），則說明檢測(cè)試劑條已經(jīng)失效，不能進(jìn)行檢測(cè)；如果C線和檢測(cè)線（以下簡(jiǎn)稱T線）均出現(xiàn)紅色條帶，而且檢測(cè)線比空白對(duì)照線顏色深或一樣深，見圖1（a）（b）。說明檢測(cè)試劑板有效，可進(jìn)行檢測(cè)。

（2）結(jié)果讀取。肉眼觀察樣品檢測(cè)結(jié)果，如果未出現(xiàn)C線，則表明操作不當(dāng)或試劑條已失效，見圖1（c）；當(dāng)待檢樣品T線出現(xiàn)紅色條帶，且顏色比C線深或一樣深則表示待檢樣品為陰性，見圖1（a），未檢測(cè)到樣品含有氯霉素﹔當(dāng)待檢樣品T線無顯色或比C線顏色淺，則表示待檢樣品為陽性，見圖1（b），檢測(cè)到樣品含有氯霉素。

圖1 氯霉素殘留檢測(cè)試紙條判定結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 靈敏度與精密度試驗(yàn)

（1）靈敏度。按照氯霉素檢測(cè)試劑盒說明書，以靈敏度試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)判定方法，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可見，該氯霉素檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品在0.1，0.5和1μg/kg CAP加標(biāo)量下均可以得出測(cè)定結(jié)果，且6次測(cè)定結(jié)果一致，檢出率為100%，假陰性率為0。

表1 氯霉素快速檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的靈敏度測(cè)試結(jié)果（n=6）

（2）精密度。該氯霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)限為0.1μg/kg，在精密度試驗(yàn)中將檢測(cè)限作為測(cè)定濃度，在空白菲律賓蛤仔中加入0.1μg/kg CAP，用同一批號(hào)產(chǎn)品在同一時(shí)間平行測(cè)定10次，測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可見，在檢測(cè)限點(diǎn)，該氯霉素試劑盒產(chǎn)品10次平行測(cè)定的結(jié)果均一致，檢出率為100%，假陰性率為0。

表2 氯霉素快速檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的精密度測(cè)試結(jié)果（n=10）

2.2 停藥后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量變化

停藥后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量判定結(jié)果見表3。由表3可見，經(jīng)低質(zhì)量濃度CAP（0.25 mg/L）處理的菲律賓蛤仔在海水暫養(yǎng)的24 h內(nèi)，氯霉素殘留檢測(cè)試紙條判定結(jié)果均為陰性；經(jīng)中質(zhì)量濃度CAP（1.5 mg/L）處理的菲律賓蛤仔在海水暫養(yǎng)的24 h內(nèi)，在0~18 h時(shí)，氯霉素殘留檢測(cè)試紙條判定結(jié)果均為陽性，在第24 h時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；經(jīng)高質(zhì)量濃度CAP（5 mg/L）處理的菲律賓蛤仔在海水暫養(yǎng)的24 h內(nèi)，氯霉素殘留檢測(cè)試紙條判定結(jié)果均為陽性。另外，菲律賓蛤仔經(jīng)0.25 mg/L氯霉素處理4 h后，其體內(nèi)未能檢出CAP殘留；經(jīng)1.5和5 mg/L CAP處理后，其體內(nèi)檢出CAP初始?xì)埩簟?/p>

表3 停藥后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量判定結(jié)果①

菲律賓蛤仔中CAP初始?xì)埩袅侩S氯霉素給藥濃度的增加而增加，且CAP殘留量隨暫養(yǎng)時(shí)間的增加而減少。李愛等[6]做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔組織中氯霉素初始?xì)埩袅侩S氯霉素給藥量的增加而增加，并且氯霉素殘留量隨停藥時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，該結(jié)果與文章結(jié)論相符，說明快速檢測(cè)方法在基礎(chǔ)理論研究中有一定的實(shí)際意義，可作為樣品條件篩選的依據(jù)。

2.3 換水處理后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量變化

經(jīng)5 mg/L CAP溶液處理停藥后，菲律賓蛤仔采用換水處理暫養(yǎng)24 h，換水頻率分別為間隔1，3和6 h/次。換水后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量判定結(jié)果見表4。由表4可見，未換水的菲律賓蛤仔在24 h內(nèi)，氯霉素殘留檢測(cè)試紙條判定結(jié)果均為陽性；換水頻率為間隔1，3，6 h/次，在第0~12 h時(shí)，氯霉素殘留檢測(cè)試紙條判定結(jié)果均為陽性；從第18 h開始，判定結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。

表4 換水后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量判定結(jié)果①

在CAP初始?xì)埩袅恳恢碌那闆r下，換水可有效降低菲律賓蛤仔中CAP殘留量，但換水頻率對(duì)CAP殘留量影響不大。原因可能是換水處理能保證菲律賓蛤仔的正常生命活動(dòng)，保持其代謝能力。而未換水處理的菲律賓蛤仔在24 h暫養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝物流入海水溶液中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，代謝物增加，生存環(huán)境變得惡劣，其本身的代謝能力降低，從而影響氯霉素代謝。

2.4 換水和預(yù)煮協(xié)同處理后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量變化

經(jīng)5 mg/L CAP溶液處理停藥后，菲律賓蛤仔采用換水處理暫養(yǎng)24 h，測(cè)定前采用沸水預(yù)煮處理10 min。換水和預(yù)煮協(xié)同處理后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量判定結(jié)果見表5。

表5 換水和預(yù)煮協(xié)同處理后菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量判定結(jié)果①

由表5可見，經(jīng)過間隔1 h換一次水后，在第0~8 h沸水預(yù)煮10 min時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均為陽性；從第12 h開始，檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。經(jīng)過間隔3和6 h換一次水后，在第0~12 h沸水預(yù)煮10 min時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均為陽性；從第18 h開始，檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。

在CAP初始?xì)埩袅恳恢碌那闆r下，當(dāng)換水頻率較高（間隔1 h/次）時(shí)，與換水處理相比換水和預(yù)煮協(xié)同處理能明顯降低殘留量，在處理的第12 h氯霉素檢測(cè)結(jié)果已為陰性。當(dāng)換水頻率相對(duì)較低（間隔3、6 h/次）時(shí)，換水和預(yù)煮協(xié)同處理對(duì)氯霉素殘留量影響較小。

3 結(jié)論

氯霉素快速檢測(cè)試劑盒具有高靈敏度和高精確度，其檢測(cè)限基本滿足目前對(duì)氯霉素監(jiān)控的限量要求。用膠體金免疫層析法測(cè)定菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量的變化，發(fā)現(xiàn)氯霉素初始?xì)埩袅侩S氯霉素給藥濃度的增加而增加，且氯霉素殘留量隨暫養(yǎng)時(shí)間的增加而減少；在氯霉素初始?xì)埩袅恳恢碌那闆r下，換水能有效降低菲律賓蛤仔中氯霉素殘留量，但換水頻率對(duì)氯霉素殘留量影響不大；當(dāng)換水頻率較高時(shí)，換水和預(yù)煮協(xié)同處理能明顯降低氯霉素殘留量。

試驗(yàn)結(jié)果表明，快速檢測(cè)方法在基礎(chǔ)理論研究中具有一定的實(shí)際意義，可作為樣品條件篩選的依據(jù)。