胡 北，史 英，張朝紳，許子華 （中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

美沙拉嗪化學(xué)名為5-氨基水楊酸，是輕、中度潰瘍性結(jié)腸炎有效的一線(xiàn)治療藥物。它直接作用于炎癥黏膜，可抑制引起炎癥的前列腺素合成、抑制炎癥介質(zhì)白三烯的形成而起抗炎作用，具有療效好及毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。美沙拉嗪口服后在體內(nèi)被迅速吸收，在腸腔及肝臟中經(jīng)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶代謝為主要產(chǎn)物N-乙酰-5-氨基水楊酸。一般認(rèn)為，其在腸腔黏膜局部濃度越大越有利于發(fā)揮作用[3]。

目前市售的美沙拉嗪藥物有美沙拉嗪緩釋顆粒劑（Etiasa）、美沙拉嗪腸溶片等劑型，考慮到人們的用藥方便和美沙拉嗪的作用部位，課題組開(kāi)發(fā)了美沙拉嗪藥物的新劑型，即美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑，以期同時(shí)發(fā)揮藥物腸溶和緩釋的作用效果，均勻釋放、定位起效，達(dá)到更好、更有效的治療潰瘍性結(jié)腸炎并減輕毒副作用的效果。為了考察美沙拉嗪新制劑與市售制劑的區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)考察了美沙拉嗪新制劑臨床前體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征，以市售制劑為參比，考察新制劑的相對(duì)生物利用度，進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較評(píng)價(jià)；并且進(jìn)一步考察了美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑的制劑學(xué)腸溶和緩釋特點(diǎn)，評(píng)價(jià)作用部位釋放情況，為該藥新制劑提供系統(tǒng)可靠的臨床前藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步的制劑工藝和處方的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 1200L 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)瓦里安公司）；Dionex SUMMIT 高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；Jouan CR3i 型多功能高速冷凍離心機(jī)（法國(guó)Jouan 公司）；SAVANT SPD121P SpeedVac型減壓離心濃縮儀（北京塞萬(wàn)特公司）；XS205 Dual Range 型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

美沙拉嗪標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（批號(hào)：100546-200902，含量：99.8%）、乙酰美沙拉嗪標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（批號(hào)100711-200401，含量：99.3%）、氯唑沙宗標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品均由上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑（1 g/袋，批號(hào)DV121102-1A）為自研制劑；美沙拉嗪緩釋顆粒劑（批號(hào)：07444，規(guī)格500 mg/袋，Ethypharm 生產(chǎn)，法國(guó)）為市售制劑；甲醇（MERK 公司）、乙腈（TEDIA 公司）、甲酸（ROE SCIENTIFIC INC 公司）均為色譜純?cè)噭淮姿徜@（江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）為分析純；水為去離子水（經(jīng)Hi-Tech水純化系統(tǒng)自制）。

1.3 動(dòng)物

健康、成年SD 大鼠，體重180～220 g，雌、雄數(shù)量均等，年齡6～8 周，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0005]。

2 美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑的藥動(dòng)學(xué)研究

2.1 SD 大鼠血漿中目標(biāo)藥物濃度分析方法

2.1.1 色譜條件及質(zhì)譜檢測(cè)條件

流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L 醋酸銨水溶液（85∶15）；流速為0.4 ml/min，進(jìn)樣量10 μl[4-5]。

電噴霧離子源，負(fù)離子模式檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行一/二級(jí)質(zhì)譜分析。質(zhì)譜檢測(cè)工作參數(shù)如下：美沙拉嗪、乙酰美沙拉嗪和內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗Q1(Mass)分別是151.7、193.8、167.8；Q3(Mass)分別是107.9、149.7、131.7；掃描時(shí)間0.33s，SIM 寬0.7，Q1 峰寬3.0；Q3 峰寬2.0；Needle-4500V；Shield-25 V；霧化氣為空氣，48psi；干燥氣為空氣，300 ℃，20psi；毛細(xì)管電壓為?35 V；碰撞能分別是13、14、19 V，碰撞氣：1.84mTorr；檢測(cè)器電壓為1 650 V[6-7]。

2.1.2 溶液的配制

精密稱(chēng)取美沙拉嗪、乙酰美沙拉嗪和內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗適量，加甲醇溶解，配制成濃度為5 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后采用相應(yīng)的流動(dòng)相逐級(jí)稀釋?zhuān)玫较盗谢旌瞎ぷ魅芤汉蛢?nèi)標(biāo)溶液。同法制備質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品的系列混合工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 血漿樣品的處理

取100 μl 血漿樣品，加入氯唑沙宗溶液10 μl，渦旋；然后加入甲醇300 μl，渦旋3 min，離心10 min（8 000 r/min）；吸取上清液250 μl，再離心5 min（12 000 r/min）；吸取上清液100 μl 待測(cè)。

2.2 分析方法的確證

2.2.1 特異性

在上述分析方法下，考察樣品、內(nèi)標(biāo)和內(nèi)源性物質(zhì)的干擾情況。結(jié)果表明生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 SD 大鼠血漿中美沙拉嗪、乙酰美沙拉嗪的LC-MS/MS 典型譜圖

2.2.2 線(xiàn)性范圍和最低定量限

精密吸取美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白血漿進(jìn)行提取，配制成美沙拉嗪的濃度為0.100 2、0.200 4、0.501、2.004、5.01、10.02、20.04 μg/ml 和乙酰美沙拉嗪的濃度為0.020 12、0.050 3、0.201 2、1.006、5.03、10.06、20.12 μg/ml，進(jìn)樣分析后求得美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為Y=0.691 4C+0.031 0（r=0.999 3）、Y=3.102 2C+0.022 7（r=0.999 9），線(xiàn)性范圍為0.100 2～20.04 μg/ml 和0.020 12～20.12 μg/ml，最低定量限分別為0.100 2 和0.020 12 μg/ml（S/N>5）。

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

按照上述方法配制最低定量限、低、中、高4 個(gè)濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品，美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度分別為0.100 4、0.020 04，0.200 8、0.050 1，2.008、1.002 和16.064、16.032 μg/ml。結(jié)果表明，準(zhǔn)確度和精密度滿(mǎn)足生物基質(zhì)樣品測(cè)定要求。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)和絕對(duì)回收率

在低、中、高3 個(gè)濃度下，美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪在SD 大鼠血漿中基質(zhì)效應(yīng)在70%～98%之間，絕對(duì)回收率在70%～90%之間，表明內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)被測(cè)物質(zhì)存在一定的抑制或增強(qiáng)的作用，但不影響樣品的分析測(cè)定。

2.2.5 穩(wěn)定性

血漿樣品在室溫下放置4h、?80 ℃保存60 d，處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置24 h，以及3 次凍融循環(huán)后樣品均保持穩(wěn)定，RSD 在15%以?xún)?nèi)。結(jié)果表明，各生物基質(zhì)樣品在所考察的時(shí)間和條件下穩(wěn)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響可以忽略。

2.3 藥動(dòng)學(xué)研究

12 只成年、健康SD 大鼠，雌性、雄性各半，隨機(jī)分成2 組，每組6 只；分別灌胃給予自研制劑和市售制劑各0.1 g/kg。

分別于給藥前及給藥后的1、2、3、4、5、6、8、12、24、36 和48 h，從SD 大鼠眼眶取血，置肝素化EP 管中，離心，取上層血漿，置于?80 ℃冰箱保存待測(cè)。按照上述樣品前處理的方法對(duì)生物基質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，并進(jìn)樣分析，計(jì)算目標(biāo)藥物濃度[8]。

數(shù)據(jù)處理：藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)以三因素方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用中國(guó)藥科大學(xué)開(kāi)發(fā)的藥動(dòng)學(xué)處理軟件BAPP2.0 程序計(jì)算有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2.3.1 美沙拉嗪在SD 大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

采用非房室模型法估算的以美沙拉嗪表征的兩組成年、健康SD 大鼠給予自研制劑和市售制劑0.1 g/kg 后的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1，藥時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2 自制和市售美沙拉嗪的藥時(shí)曲線(xiàn)圖

表1 口服給藥后體內(nèi)以美沙拉嗪表征的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

用梯形面積法(AUC)估算的以美沙拉嗪表征的自研制劑和市售制劑的相對(duì)生物利用度為(90.62±9.36)%，即平均生物利用度基本一致。

2.3.2 乙酰美沙拉嗪在SD 大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

采用非房室模型法估算的以乙酰美沙拉嗪表征的兩組成年、健康SD 大鼠給予自研制劑和市售制劑0.1 g/kg 后的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2，藥時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。

圖3 自制和市售乙酰美沙拉嗪的藥時(shí)曲線(xiàn)圖

表2 口服給藥后體內(nèi)以乙酰美沙拉嗪表征的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

采用梯形面積法(AUC)估算的以乙酰美沙拉嗪表征的自研制劑和市售制劑的相對(duì)生物利用度為(87.36±10.43)%，即平均生物利用度基本一致。

3 美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑胃腸道分布和藥物殘留研究

3.1 SD 大鼠胃腸道內(nèi)容物中目標(biāo)藥物濃度分析方法

3.1.1 胃腸道內(nèi)容物分析方法

流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L 醋酸銨水溶液（2∶98）；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為304 nm，柱溫25 ℃。

3.1.2 溶液的配制

精密稱(chēng)取美沙拉嗪適量，加甲醇溶解，配成濃度為5 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用相應(yīng)的流動(dòng)相來(lái)逐級(jí)稀釋?zhuān)玫较盗谢旌瞎ぷ魅芤汉蛢?nèi)標(biāo)溶液。同法制備質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品的系列混合工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液。

3.1.3 胃腸道內(nèi)容物的處理

將SD 大鼠胃腸消化道分段內(nèi)容物樣品在室溫下解凍，將藥物顆粒數(shù)量大于5 粒的內(nèi)容物樣品轉(zhuǎn)移至100 ml 燒杯中，攪拌均勻，再準(zhǔn)確加入50 ml去離子水清洗相應(yīng)的消化道分段，并溶解其內(nèi)容物；藥物顆粒數(shù)量小于5 粒的內(nèi)容物樣品轉(zhuǎn)移至10 ml EP 離心管中，攪拌均勻，再準(zhǔn)確加入5 ml 去離子水清洗相應(yīng)的消化道分段，并溶解其內(nèi)容物[9-10]；分別超聲溶解各內(nèi)容物樣品20 min，取1 ml 溶液12 000 r/min 離心10 min，分離上清液，再12 000 r/min離心10 min 后，分離上清液待測(cè)。

3.2 分析方法的確證

3.2.1 特異性

在上述分析方法下，考察了樣品和內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。結(jié)果表明生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾美沙拉嗪的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖8。

圖4 大鼠胃內(nèi)容物樣品中美沙拉嗪的HPLC 圖

圖5 大鼠十二指腸內(nèi)容物樣品中美沙拉嗪的HPLC 圖

圖6 大鼠空腸內(nèi)容物樣品中美沙拉嗪的高效液相色譜圖

圖7 大鼠回腸內(nèi)容物樣品中美沙拉嗪的HPLC 圖

圖8 大鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣品中美沙拉嗪的HPLC 圖

3.2.2 線(xiàn)性范圍和最低定量限

精密吸取適量美沙拉嗪，用空白胃內(nèi)容物提取上清液，配制成美沙拉嗪濃度分別為0.504 5、1.009、5.045、10.09、20.18、50.45 和100.9 μg/ml 的溶液，進(jìn)樣分析，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.130 8C+0.005 3（r=0.999 6），線(xiàn)性范圍為0.504 5～100.9 μg/ml，最低定量限為0.504 5 μg/ml（S/N>5）；用空白腸道內(nèi)容物提取上清液配制成美沙拉嗪濃度分別為0.513 5、1.027、5.135、10.27、20.54、51.35 和102.7 μg/ml，進(jìn)樣分析后求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.196 1C-0.008 1，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍為0.513 5～102.7 μg/ml，最低定量限為0.513 5 μg/ml（S/N>5）。

3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

按照上述方法配制最低定量限、低、中、高4 個(gè)濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品，SD 大鼠胃內(nèi)容物美沙拉嗪質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為0.502、1.004、10.04 和80.32 μg/ml，SD 大鼠腸內(nèi)容物美沙拉嗪質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為0.504、1.008、10.08、80.64 μg/ml。結(jié)果表明，準(zhǔn)確度和精密度滿(mǎn)足生物基質(zhì)樣品測(cè)定要求。

3.2.4 基質(zhì)效應(yīng)和絕對(duì)回收率

在最低定量限、低、中、高4 個(gè)濃度下，SD 大鼠胃腸道內(nèi)容物中美沙拉嗪的絕對(duì)回收率在95%～99%之間，表明內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)被測(cè)物質(zhì)存在一定的抑制或增強(qiáng)的作用，但不影響樣品的分析測(cè)定。

3.2.5 稀釋效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)生物基質(zhì)中藥物濃度大于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上限，須經(jīng)稀釋后再測(cè)定，故考察了稀釋效應(yīng)。配制高濃度的質(zhì)控樣品，稀釋相應(yīng)倍數(shù)至高濃度，按照生物樣品前處理方法進(jìn)樣測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得美沙拉嗪濃度，稀釋效應(yīng)采用測(cè)定值與理論值RE 值表示。結(jié)果表明，樣品經(jīng)稀釋后分析結(jié)果準(zhǔn)確，能滿(mǎn)足生物基質(zhì)樣品分析要求。

3.2.6 穩(wěn)定性

胃腸道樣品在室溫下放置4 h、?80 ℃長(zhǎng)期保存60 d、處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置36 h，以及3 次凍融循環(huán)后樣品均保持穩(wěn)定，RSD 在15%以?xún)?nèi)。結(jié)果表明，各生物基質(zhì)樣品在所考察的時(shí)間和條件下穩(wěn)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響可以忽略。

3.3 美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑胃腸道分布和藥物殘留研究

選用60 只成年、健康SD 大鼠，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)SD 大鼠禁食過(guò)夜（禁食15 h）后，隨機(jī)分成2 大組，分別以100 mg/kg 給予自研制劑和市售制劑；每一大組又隨機(jī)分成5 小組，每小組6 只，選取給藥后2、4、6、8 和12 h 的大鼠胃腸消化道內(nèi)分布的美沙拉嗪顆粒及藥物殘留量。另取6 只SD 大鼠（雌雄各半）作為空白對(duì)照，同樣禁食過(guò)夜（禁食15 h）。分別于給藥后2、4、6、8 和12 h（每一時(shí)間點(diǎn)各6 只SD 大鼠），將SD 大鼠乙醚麻醉，完整取出胃、十二指腸段、空腸段、回腸段和結(jié)腸段組織，分段解剖分離藥物顆粒及內(nèi)容物，置于?80 ℃冰箱保存待測(cè)。按胃腸消化道分段內(nèi)容物樣品預(yù)處理方法操作，測(cè)定胃腸消化道內(nèi)容物中美沙拉嗪的濃度[11-12]。

由胃腸消化道內(nèi)容物中美沙拉嗪濃度計(jì)算而得的自制和市售兩種美沙拉嗪緩釋顆粒相應(yīng)的胃腸道美沙拉嗪殘留量結(jié)果見(jiàn)圖9 和圖10。

圖9 自研制劑在消化道各部位不同時(shí)間點(diǎn)的藥物殘留量

圖10 市售制劑在消化道各部位不同時(shí)間點(diǎn)的藥物殘留量

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠口服給藥考察了美沙拉嗪腸溶緩釋顆粒劑的藥動(dòng)學(xué)特征、相對(duì)生物利用度，并與市售制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，自研制劑口服后給藥后吸收和消除過(guò)程基本呈線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)特征。通過(guò)相對(duì)生物利用度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析比較，提示自研制劑與市售制劑無(wú)顯著性差異。

從藥物顆粒分布結(jié)果看，自研制劑的微丸在SD 大鼠胃腸消化道內(nèi)具有一定流動(dòng)性，且包衣對(duì)胃腸消化液的耐受性較好，隨著SD 大鼠胃腸消化道的蠕動(dòng)，緩釋顆粒微丸會(huì)逐步進(jìn)入空腸、回腸和結(jié)腸，崩解并釋放藥物產(chǎn)生治療作用；市售制劑微丸在SD 大鼠胃腸消化道內(nèi)流動(dòng)性好，緩釋顆粒微丸會(huì)較快進(jìn)入空腸、回腸和結(jié)腸，崩解并釋放藥物產(chǎn)生治療作用，同時(shí)，包衣在胃腸消化液中可能存在一定耐受性問(wèn)題，使不同時(shí)間點(diǎn)胃腸消化道不同部位出現(xiàn)部分微丸的崩解，造成藥物提前釋放。

從美沙拉嗪不同部位藥物含量看，自研制劑口服給藥后在2～8 h 時(shí)間段胃部?jī)?nèi)容物均存在高濃度分布，并隨著時(shí)間的推移較快進(jìn)入并存在于空腸、回腸和結(jié)腸，隨后在6～12 h 后，逐步在結(jié)腸達(dá)到高濃度分布，其結(jié)果有助于美沙拉嗪藥物的體內(nèi)吸收，以及緩釋顆粒劑在作用部位的定點(diǎn)釋放而發(fā)揮治療效果；市售制劑SD 大鼠口服后，緩釋顆粒微丸會(huì)較快進(jìn)入十二指腸、空腸、回腸、甚至結(jié)腸，在2～6 h 時(shí)間段回腸內(nèi)容物相對(duì)維持較高濃度分布，并隨著時(shí)間的推移較快進(jìn)入結(jié)腸，使結(jié)腸內(nèi)容物中藥物含量在4～12 h 時(shí)間段內(nèi)持續(xù)較高水平，有利于藥物在作用位點(diǎn)及時(shí)釋放以提高療效。