陳佳莉，馮琨，劉曉雯，張晗，林黛英，步軍

肺癌是發(fā)病率、病死率最高的腫瘤，占總惡性腫瘤新發(fā)病例的13%[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌類型，約占所有肺癌的80%[3]，NSCLC中最常見的是腺癌和鱗癌。大多數(shù)NSCLC患者發(fā)現(xiàn)時為中晚期，失去手術(shù)切除的機(jī)會，此時放化療是其主要治療方案。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促進(jìn)腫瘤血管增生，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在缺氧狀態(tài)下表達(dá)增多，細(xì)胞增殖核抗原(nuclear-associated antigen，Ki-67)可反映腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此，本研究通過探討NSCLC的CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)參數(shù)與VEGF、HIF-1α與Ki-67的關(guān)系，可以通過CT灌注無創(chuàng)性獲得肺癌組織中的分子指標(biāo)表達(dá)情況，為肺癌分子靶向治療的動態(tài)監(jiān)測提供幫助。

材料與方法

1.一般資料

搜集2018年2月-2018年12月在廣州市紅十字會醫(yī)院住院行64層螺旋CT胸部灌注掃描并經(jīng)病理證實為NSCLC的患者24例，腺癌17例，鱗癌7例，男21例，女3例，平均年齡(64.88±10.00)歲，病灶最大徑1.1～9.0 cm，平均(4.34±2.08) cm，平掃病灶實性部分平均CT值(41.92±9.73) HU。

所有患者均簽署知情同意書，本研究得到醫(yī)院倫理委員會許可。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①CT常規(guī)掃描顯示肺內(nèi)單發(fā)直徑大于1 cm的實性腫物患者；②排除其他部位原發(fā)腫瘤病史；③未經(jīng)臨床治療；④穿刺或者手術(shù)病理證實為NSCLC并行VEGF、HIF-1α、Ki-67免疫組化檢查。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①呼吸頻率過快，經(jīng)呼吸訓(xùn)練控制后仍不能配合檢查者；②因各種原因未進(jìn)行手術(shù)切除或無法耐受CT引導(dǎo)下穿刺活檢，未取得病理結(jié)果；③病理結(jié)果為炎性病變、結(jié)核球；④腫塊壞死嚴(yán)重，興趣區(qū)內(nèi)不能測得完整的灌注參數(shù)；⑤穿刺組織過少無法進(jìn)行免疫組化檢查。

2.CT灌注檢查方法

患者準(zhǔn)備：①向患者詳細(xì)說明檢查目的、方式，詢問有無檢查禁忌證、碘劑過敏史，簽署知情同意書；②對患者進(jìn)行呼吸訓(xùn)練，指導(dǎo)患者練習(xí)吸氣后屏氣，要求在掃描中重復(fù)屏氣的呼吸深度相同。

掃描方法：采用荷蘭Philips Brilliance 64 CT掃描儀，對比劑采用優(yōu)維顯(Ultravist，300 mg I/mL，德國拜耳先靈公司)。先行全肺常規(guī) CT 平掃，檢查范圍自胸廓入口至雙側(cè)肋膈角水平，全程患者平靜呼吸。掃描參數(shù)：管電壓120 kV，管電流200 mAs，矩陣512×512，螺距0.795，層厚3 mm。灌注掃描：選取平掃病灶最大截面為灌注掃描的中心層面，然后用高壓注射器經(jīng)肘靜脈注射優(yōu)維顯50 mL，流率為5 mL/s，延遲5 s后開始灌注掃描，總灌注掃描時間約30 s。掃描參數(shù)：管電壓120 kV，管電流100 mAs，矩陣512×512，掃描時間1 s/轉(zhuǎn)，層厚2.5 mm，準(zhǔn)直器64×0.625。

圖像后處理及數(shù)據(jù)分析：將掃描的圖像傳送至Philips Extended BrillianceTM WorkspaceXXX工作站，采用Philips CT Perfusion軟件包進(jìn)行分析。選取病灶實性成分最大層面進(jìn)行分析，先在主動脈上手動勾畫ROI(若該層面無主動脈則選取頸總動脈)，接著勾畫病灶ROI，生成偽彩圖和灌注指標(biāo)，包括灌注值(Perfusion)、血容量(blood volume，BV)、強(qiáng)化峰值(peak enhancement image，PEI)及達(dá)峰時間(time to peak，TTP)，見圖1。兩位副主任醫(yī)師基于同一組灌注圖像，通過相同的方法獲得灌注參數(shù)值，并將其均值作為統(tǒng)計結(jié)果。病灶ROI的選擇：手動繪制ROI，在避開壞死、大血管、含氣區(qū)域、偽影等，盡量選取或包含較大范圍的腫瘤組織[4]。

3.免疫組化測定方法

采用SP二分法測定NSCLC組織中的VEGF、HIF-1α、Ki-67表達(dá)情況。采用福州邁新生物技術(shù)有限公司即用型鼠抗人VEGF單克隆抗體(克隆號：VG1)、即用型鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號：MIB-1)，碧云天生物有限公司即用型鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(克隆號：H1α67)。石蠟切片水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，接著滴加一抗、二抗，顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

每批染色設(shè)定陰性內(nèi)對照(用PBS代替一抗)，用已知的陽性切片作為陽性對照。均由兩位病理科醫(yī)師按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，如有分歧，則協(xié)商一致。

VEGF、HIF-1α結(jié)果判定：VEGF蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞漿顯示棕黃色顆粒；HIF-1α 蛋白陽性表達(dá)為在胞核和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)觀察5個高倍視野(×200)，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例：<25%為1分，25%～49%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。兩者得分相乘，0～1分為(-)，2～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()，見圖2～5。

圖1 男，58歲，右肺上葉后段腺癌。a) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為24.81 mL/(min·100mL)； b) PEI偽彩圖，PEI值為8.96 HU； c) TTP偽彩圖，TTP值為10.36 s； d) BV偽彩圖，BV值為2.64 mL/100g； e) CT平掃縱膈窗，顯示右肺上葉后段結(jié)節(jié)，大小約2.7 cm×2.4 cm，見短毛刺，鄰近胸膜牽拉增厚； f) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結(jié)果為(-)。

圖2 男，54歲，左肺下葉背段腺癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示左肺下葉背段分葉狀結(jié)節(jié)，大小約2.2 cm×1.1 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為55.54 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結(jié)果為(+)。 圖3 女，56歲，左肺下葉前基底段腺癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示左肺下葉前基底段略呈分葉狀結(jié)節(jié)，大小約2.2 cm×1.6 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為68.83 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結(jié)果為()。

Ki-67結(jié)果判定：Ki-67蛋白陽性表達(dá)為胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，每張切片隨機(jī)觀察5 個高倍視野(×200)，根據(jù)陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分：(-)，陽性細(xì)胞數(shù)<25% ；(+) ，陽性細(xì)胞數(shù)25%～49% ；()，陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%；()，陽性細(xì)胞數(shù)>75%。

圖4 男，56歲，右肺上葉后段腺癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示右肺上葉后段形態(tài)不規(guī)則腫塊影，大小約3.3 cm×2.4 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為96.67 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結(jié)果為()。 圖5 女，77歲，右肺下葉外基底段鱗癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示右肺下葉外基底段不規(guī)則腫塊，大小約3.3 cm×4.7 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為72.55 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結(jié)果為()。

表1 非小細(xì)胞肺癌CT灌注參數(shù)與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關(guān)分析

4.統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

1.非小細(xì)胞肺癌CT灌注參數(shù)及免疫組化結(jié)果

24例NSCLC中，Perfusion平均值為(65.51±23.15)mL/(min·100mL)，BV平均值為(9.87±9.55)mL/100g，PEI平均值為(25.54±20.08)HU，TTP平均值為(11.91±6.45)s。

HIF-1α：陰性(-)12例，弱陽性(+)11例，中度陽性()1例，強(qiáng)陽性()0 例，總陽性率50%。

Ki-67：陰性(-)9例，弱陽性(+)3 例，中度陽性()8例，強(qiáng)陽性()4例，總陽性率62.5%。

2.非小細(xì)胞肺癌 CT灌注參數(shù)與VEGF、HIF-1α、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

Perfusion、 BV與VEGF 表達(dá)呈正相關(guān)，且Perfusion與VEGF相關(guān)性較高(r=0.698，P<0.001；r=0.474，P=0.019)。PEI、TTP與VEGF的表達(dá)沒有相關(guān)性(P均>0.05)。

Perfusion與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.446，P=0.029)。BV、PEI、TTP與HIF-1α的表達(dá)沒有相關(guān)性(P均>0.05)。

Perfusion、BV、PEI、TTP與Ki-67的的表達(dá)沒有相關(guān)性(P均>0.05，表1)。

表2 肺腺癌中CT灌注參數(shù)與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關(guān)分析

表3 肺鱗癌中CT灌注參數(shù)與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關(guān)分析

3.肺腺癌 CT灌注參數(shù)與VEGF、HIF-1α、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

肺腺癌中Perfusion與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.624，P=0.007，圖2～4)，BV、PEI、TTP與VEGF的表達(dá)沒有相關(guān)性(P均>0.05)。肺腺癌 CTPI參數(shù)與HIF-1α、Ki-67的表達(dá)均沒有相關(guān)性(P均>0.05，表2)。

4.肺鱗癌 CTPI參數(shù)與VEGF、HIF-1α、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

肺鱗癌中Perfusion與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.896，P=0.006)，BV、PEI、TTP與VEGF的表達(dá)沒有相關(guān)性(P均>0.05)。肺鱗癌 CTPI參數(shù)與HIF-1α、Ki-67的表達(dá)均沒有相關(guān)性(P均>0.05，表3)。

討 論

肺癌是最常見的癌癥死亡原因，每年有1800萬人被診斷患有肺癌，有1600萬人因肺癌而死亡[2]。臨床上很多NSCLC患者發(fā)現(xiàn)時常為中晚期，此時通過對患者進(jìn)行基因檢測，根據(jù)結(jié)果采取靶向藥物治療是有效措施[5]，近年來部分分子靶向藥物治療已在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，如針對EGFR的吉非替尼，針對VEGF的PTK787藥物[6]。分子靶向藥物必須確定腫瘤細(xì)胞中存在過度表達(dá)才有效。通過探討CT灌注掃描是否能無創(chuàng)性提供分子指標(biāo)在肺癌中的表達(dá)情況，可以為臨床診斷、治療提供個性化方案。

VEGF是促進(jìn)血管生成的最具特異性和關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子之一，在腫瘤血管形成過程中起著重要作用[7]，而CT灌注可以無創(chuàng)性提供腫瘤組織中微循環(huán)內(nèi)血流動力學(xué)變化的信息[8]。本研究24例NSCLC證明Perfusion、 BV與NSCLC組織中的VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.698、0.474)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與Ling等[9]學(xué)者研究相符。接著進(jìn)一步對肺腺癌、鱗癌CTPI參數(shù)與VEGF表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，提示Perfusion與肺腺癌、鱗癌中VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.624、0.896)，BV與腺癌、鱗癌中VEGF表達(dá)沒有顯著相關(guān)性。因此，筆者認(rèn)為Perfusion值更能反映腺癌、鱗癌中的血管新生情況，在對肺腺癌、鱗癌患者進(jìn)行抗血管分子靶向治療過程中，可能可以利用Perfusion值預(yù)測患者對分子靶向藥物的敏感性，指導(dǎo)后續(xù)治療方案。

腫瘤細(xì)胞無限增殖導(dǎo)致氧消耗增加，與周圍正常組織相比，大部分實體腫瘤內(nèi)部都發(fā)生缺氧。缺氧情況下，HIF-1α表達(dá)增多，NSCLC中腫瘤缺氧通常與預(yù)后不良相關(guān)[10]。本研究顯示，NSCLC組織中Perfusion與HIF-1α表達(dá)呈顯著正相關(guān)，余CTPI參數(shù)值與HIF-1α表達(dá)沒有相關(guān)性，與劉琴等[11]研究結(jié)果一致。肺癌組織細(xì)胞代謝旺盛，存在供氧和耗氧之間的不平衡，缺氧情況下，HIF-1α可轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核中，與下游基因VEGF結(jié)合，促進(jìn)新生血管形成[12]，使得腫瘤組織中的灌注量增加。然而，腫瘤組織內(nèi)缺氧面積過大，氧氣供應(yīng)不足，壞死面積增大，腫瘤組織中的灌注量也會隨之減少。本研究中，Perfusion與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，猜測可能與HIF-1α促血流量增加作用更為明顯，且本研究中入組的肺癌患者發(fā)生壞死比例較少有關(guān)。然而進(jìn)一步的亞組分析中表明，肺腺癌、鱗癌中Perfusion與HIF-1α表達(dá)沒有顯著相關(guān)性。腫瘤組織中氧消耗增加，促進(jìn)灌注量增加以適應(yīng)腫瘤缺氧微環(huán)境，故Perfusion與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，但在腺癌、鱗癌中并無顯著相關(guān)性，可能與本研究中樣本量過少、腫瘤組織的異質(zhì)性有關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為Perfusion值在一定程度上可提供腫瘤組織內(nèi)的缺氧情況。

Ki-67的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖和生長密切相關(guān)，其主要是在細(xì)胞增殖期表達(dá)，在靜止期不存在，臨床上常用其作為腫瘤增殖標(biāo)記物[13]。Ki-67在腫瘤組織中的表達(dá)可用來評估腫瘤患者的預(yù)后并發(fā)揮一定的預(yù)測作用，已有研究顯示通過顯微注射抗體或使用反義寡核苷酸阻斷Ki-67表達(dá)從而阻斷腫瘤細(xì)胞增殖[14]，故Ki-67表達(dá)可能識別并預(yù)測對特定療法產(chǎn)生反應(yīng)的患者亞群，是一種潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究顯示NSSLC中Ki-67表達(dá)與Perfusion值呈無顯著相關(guān)性。肺癌中Ki-67與CTPI參數(shù)的相關(guān)性研究國內(nèi)外鮮見報道，目前只找到如下兩篇：Sauter等[15]發(fā)現(xiàn)肺癌中Ki-67與BF值的呈負(fù)相關(guān)(r=-0.127，P>0.05)，與本研究結(jié)果一致。然而，國內(nèi)劉佩等[16]采用雙入口灌注技術(shù)探討灌注參數(shù)與Ki-67陽性表達(dá)率的相關(guān)性分析，得出BF與Ki-67陽性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.686，P<0.01)。Ki-67表達(dá)越多，腫瘤細(xì)胞增殖速度越快，Perfusion值表示單位時間內(nèi)、組織質(zhì)量的血流量，故腫瘤細(xì)胞增殖速度與Perfusion是否存在相關(guān)性，是呈正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)仍需進(jìn)一步探討。

本研究局限性：一是總體樣本量較少，且沒有HIF-1α表達(dá)強(qiáng)陽性的病例；二是未對NSCLC的分化程度與CT灌注參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步研究；三是CT灌注成像具有一定的輻射劑量。因此，在接下來的研究過程中，需增加更多的病例，進(jìn)行更詳細(xì)的指標(biāo)分類完善研究，且關(guān)于NSCLC中CT低劑量灌注掃描的可行性亦值得進(jìn)一步的探討。

綜上所述，CT灌注參數(shù)可以評價肺癌中血管新生速度，且在對肺腺癌、鱗癌患者進(jìn)行抗血管分子靶向治療過程中，可以利用CT灌注掃描預(yù)測患者對分子靶向藥物的敏感性，指導(dǎo)后續(xù)治療方案。