趙立軍，張 靜，岳 琴，林順全，廖 峰，李 云

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（成都），成都610041）

β-受體激動劑是類似腎上腺素和去甲腎上腺素功能的化學(xué)合成藥物，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為苯乙醇胺。臨床上主要用于治療支氣管炎和哮喘等疾病[1-3]，該類藥物用于畜牧生產(chǎn)，俗稱“瘦肉精”，能顯著提高動物胴體瘦肉率和提高飼料轉(zhuǎn)化率，達(dá)到動物快速增重的目的[4-5]。有研究報(bào)道，β-受體激動劑易蓄積殘留于動物體內(nèi)，特別在肺臟、肝臟、腎臟殘留量最高，嚴(yán)重危害人體健康[6-8]。福莫特羅是一種新型、高選擇性的β-受體激動劑，臨床上其具有強(qiáng)力而持續(xù)的支氣管擴(kuò)張作用，效果明顯優(yōu)于同等劑量的沙丁胺醇和特布他林[9]。福莫特羅分子中有兩個手性中心，即存在RR、SS、RS和SR四種構(gòu)型。阿福特羅是福莫特羅的RR構(gòu)型對映異構(gòu)體，其藥效約為SS構(gòu)型對映異構(gòu)體的1 000倍[10-11]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（原農(nóng)業(yè)部）1519號公告明確禁止在飼料和動物飲用水中使用酒石酸阿福特羅（Arformoterol tartrate）和富馬酸福莫特羅（Formoterol fumatrate）等β-受體激動劑[12]。

目前有關(guān)飼料中β-受體激動劑的液相色譜質(zhì)譜檢測方法很多，但主要關(guān)注的是“瘦肉精”測定[13-16]，尚無關(guān)于飼料中福莫特羅和阿福特羅總量的測定方法的報(bào)道。福莫特羅和阿福特羅是國家明令禁止在動物養(yǎng)殖中使用的物質(zhì)，只要在飼料產(chǎn)品中檢出兩者中任何一種物質(zhì)即判定為有非法添加物。為了使兩種物質(zhì)檢測方法具有可操作性和實(shí)用性，本研究利用實(shí)驗(yàn)室常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱建立了一種準(zhǔn)確、靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定福莫特羅和阿福特羅。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent1290-6460 Triple Quad）、固相萃取裝置，美國Agilent公司產(chǎn)品；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；渦旋振蕩混合器，德國IKA公司產(chǎn)品；離心機(jī)，日本Hitachi公司產(chǎn)品；氮吹儀，美國Organomation公司產(chǎn)品；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

富馬酸福莫特羅、酒石酸阿福特羅對照品（純度≥98%）、福莫特羅-D6同位素內(nèi)標(biāo)物（純度≥96%），加拿大TRC公司產(chǎn)品；Oasis MCX固相萃取柱（3 mL·60 mg-1），美國Waters公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸（色譜純），美國Sigma公司產(chǎn)品；鹽酸（分析純），重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司產(chǎn)品；乙酸鉛（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氨水（分析純），廣東西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；0.22μm有機(jī)系濾膜，天津市津滕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，德國默克產(chǎn)品。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取福莫特羅、阿福特羅及福莫特羅-D6對照品適量，用甲醇配制成濃度約為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于2~8℃冷藏保存，有效期為6個月。使用時用0.2%甲酸水溶液逐級稀釋至所需濃度。

鹽酸甲醇提取液：取0.1 mol·L-1鹽酸80 mL，加入甲醇20 mL，混勻。

飽和醋酸鉛溶液：50 mL水中加入適量的醋酸鉛，超聲5 min，直至固體不再溶解。

5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水，用甲醇稀釋至100 mL。

0.2 %甲酸水溶液：取甲酸1 mL，加水定容至500 mL。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo scientific BDS Hypersil C18（2.4μm，100 mm×2.1 mm）；流動相為甲醇（A）和0.2%甲酸水溶液（B）；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：4μL；柱溫：30℃；梯度洗脫程序：開始時20%A，3 min 80%A；3.0~5.5 min 80%A；5.6 min 20%A；5.6~10.0 min 20%A。分析總時間為10 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI電噴霧離子源；掃描方式：正離子；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：350℃，流速：10 L·min-1，霧化器壓力：276 kPa，鞘氣流速：11 L·min-1，鞘氣溫度：250℃，毛細(xì)管電壓：3.5 kV，碰撞氣體為氮?dú)狻８Ｄ亓_和阿福特羅的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 福莫特羅和阿福特羅的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理?xiàng)l件

稱取2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，分別準(zhǔn)確加入福莫特羅-D6內(nèi)標(biāo)工作液100μL、19 mL鹽酸甲醇提取液和1 mL飽和醋酸鉛溶液，搖勻，充分振蕩20 min，于7 000 r/min離心10 min，取上清液作為備用液。

將固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，準(zhǔn)確移取5 mL備用液過柱，依次用2 mL水、2 mL甲醇淋洗，真空抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或50℃氮吹至干，用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，過0.22μm濾膜后上機(jī)測定。若試樣液中含有的待測物濃度超出線性范圍，進(jìn)樣前可用一定體積的0.2%甲酸水溶液稀釋，使其濃度在線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶劑和凈化條件的確定

福莫特羅和阿福特羅微溶于水，幾乎不溶于乙腈，溶于甲醇。根據(jù)其在不同試劑中的溶解性，試驗(yàn)分別選取甲醇、鹽酸甲醇、乙酸銨甲醇作為提取溶劑，對添加濃度為1.0 mg·kg-1的乳豬配合飼料樣品進(jìn)行測定，根據(jù)儀器響應(yīng)值確定最佳提取溶劑。結(jié)果表明，使用鹽酸甲醇作為提取溶劑時，回收率最高，色譜峰干擾雜質(zhì)少，提取液中加入的飽和醋酸鉛能有效沉淀樣品中的蛋白和脂肪，達(dá)到了提取和部分凈化的要求。提取液中甲醇比例僅為20%，其價格低廉易得，對操作人員危害小，溶劑更加安全環(huán)保。酸性的提取液使堿性待測物呈離子化狀態(tài)，既可增強(qiáng)其溶解性，又利于凈化中與萃取柱進(jìn)行離子交換保留，提高提取回收率。

飼料普遍本底復(fù)雜，可能含有動物蛋白、植物蛋白、色素及多種礦物元素。福莫特羅或阿福特羅在配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料中使用劑量不同，因此試驗(yàn)分別對各類飼料樣品進(jìn)行了凈化條件的研究。選取實(shí)驗(yàn)室常見的十八烷基硅膠（C18）、混合型陽離子（MCX）、親脂親水性（HLB）固相萃取柱分別考察其對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留性以及添加濃度為1.0 mg·kg-1的乳豬配合飼料、豬濃縮飼料、豬復(fù)合預(yù)混合飼料樣品的回收率。結(jié)果表明MCX柱對不同飼料樣品的凈化效果最理想，特別是對于含礦物元素較高的添加劑預(yù)混料的回收率較高。由福莫特羅和阿福特羅結(jié)構(gòu)式可知，其屬于弱堿性化合物，MCX混合型陽離子固相萃取柱具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對離子化的弱堿性化合物保留能力強(qiáng)，絕對回收率高。因此，本試驗(yàn)最終選擇MCX萃取柱為凈化柱，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀高分離能力、高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn)。該方法可適用于實(shí)驗(yàn)室大批量樣品檢測。

2.2 色譜條件的確定

若要分別測定福莫特羅和阿福特羅的含量，首先應(yīng)將外消旋體分離。目前外消旋體的拆分方法主要有不對稱催化合成、Chiron方法、色譜法等[17]，其中在檢測分析中以色譜法居多，主要通過引入手性環(huán)境或?qū)⑼庀w轉(zhuǎn)變?yōu)槔砘再|(zhì)差異顯著的非對映異構(gòu)體來實(shí)現(xiàn)手性分離[18]。目前色譜法分離對映體主要采用手性色譜柱，固定相主要包括多糖、環(huán)糊精、冠醚等[19]，這些固定相與對映體間可能存在靜電、氫鍵、π-π、偶極-偶極等作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)外消旋體的拆分。手性色譜柱售價一般是普通色譜柱的2~3倍，且流動相的pH值和柱溫對分析結(jié)果影響顯著，目前尚無一種普遍適用的手性柱，因此給手性化合物的分離造成極大的困難。福莫特羅和阿福特羅均為國家規(guī)定的在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)禁止使用的化合物，因此只要在飼料中檢出兩者中任何一種物質(zhì)即判定為非法添加物。為使方法具有可操作性和實(shí)用性，本試驗(yàn)選用檢測機(jī)構(gòu)普遍采用的C18色譜柱對福莫特羅和阿福特羅的總量進(jìn)行測定，極大節(jié)約了檢測成本，可實(shí)現(xiàn)與β-受體激動劑其他物質(zhì)的同時檢測。

根據(jù)待測物理化性質(zhì)，分別選用甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水溶液、甲醇-50 mmol·L-1乙酸銨水溶液作流動相，其他條件同“1.3”所述，對質(zhì)量濃度為20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行測定，以色譜峰的響應(yīng)值和分離效果為評判依據(jù)，確定最佳流動相比例。結(jié)果表明，采用甲醇-0.2%甲酸水溶液作流動相時的信號響應(yīng)值最高，分離效果滿意，試驗(yàn)結(jié)果與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[20]一致。在質(zhì)譜正離子模式和電噴霧離子源條件下，流動相中添加一定量的甲酸不僅能提高待測物的離子化效率，而且有利于色譜峰形的改善，從而提高方法的靈敏度，因此本方法選其作為流動相。

2.3 定性和定量離子對的確定

在質(zhì)譜儀正離子模式下，可不安裝色譜柱，直接將液相色譜與質(zhì)譜用兩通連接，將0.5μg·mL-1的福莫特羅、阿福特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液以及福莫特羅內(nèi)標(biāo)物分別進(jìn)行母離子掃描，確定各化合物的分子離子峰，并優(yōu)化其錐孔電壓。將上述分子離子作為母離子，在碰撞氣體和適當(dāng)碰撞能量的作用下對其進(jìn)行子離子全掃描， 選取兩組豐度最高、質(zhì)荷比大、干擾較小的子離子，將豐度較高的作為定量離子，次之的作為定性離子。將上述母離子和兩組子離子組成監(jiān)測離子對并進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。該監(jiān)測離子對為待測物的質(zhì)譜檢測條件，滿足歐盟2002/EC/657對質(zhì)譜定性4個識別點(diǎn)的指令要求，即1個母離子為1.0個識別點(diǎn)，2個對應(yīng)的子離子為2×1.5個識別點(diǎn)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

精密量取適量福莫特羅或阿福特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液，用0.2%甲酸水稀釋定容，制得1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1各系列工作溶液，內(nèi)標(biāo)物濃度均為25 ng·mL-1，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以待測物峰面積與其內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明待測物在1.0~100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.040 8x-0.007 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白樣品中，按照1.4和1.3要求進(jìn)行前處理和測定，依據(jù)待測物信噪比S/N>3和S/N>10分別確定方法檢出限（Limit of de?tection，LOD）為0.01 mg·kg-1和定量限（Limit of quantity，LOQ）為0.05 mg·kg-1。本方法定量分析采用內(nèi)標(biāo)法校正，消除了樣品基質(zhì)對測定結(jié)果的影響，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)操作的重現(xiàn)性。

2.4.2 方法選擇性

豬配合飼料和標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖見圖1~圖3。

圖1 空白豬配合飼料特征離子色譜圖

圖3 福莫特羅、阿福特羅及內(nèi)標(biāo)物（20 ng·mL-1）特征離子色譜圖

圖2 空白豬配合飼料添加回收（0.5 mg·kg-1）特征離子色譜圖

分別選取豬配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料進(jìn)行方法定量限濃度添加回收試驗(yàn)，由試驗(yàn)結(jié)果可知，待測物色譜峰雜質(zhì)干擾少，響應(yīng)信號強(qiáng)，滿足測定的要求。

另外，試驗(yàn)考察了福莫特羅和阿福特羅的同分異構(gòu)體苯乙醇胺A對測定的干擾[12]，多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖4。雖然苯乙醇胺A的母離子和其中一個子離子與福莫特羅完全相同，但在現(xiàn)有色譜條件下，兩個化合物實(shí)現(xiàn)了完全的分離，苯乙醇胺A不會對福莫特羅的測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。

圖4 苯乙醇胺A與福莫特羅特征離子色譜圖

2.4.3 回收率與精密度

為進(jìn)一步考察方法的準(zhǔn)確性和精密度，選取空白豬配合飼料和雞配合飼料在0.05、0.10、1.00 mg·kg-1水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)；選取空白豬濃縮飼料和空白雞濃縮飼料分別在0.05、1.00、10.00 mg·kg-1水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)；選取空白豬復(fù)合預(yù)混料在0.05、1.00、20.0 mg·kg-1水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。每個添加濃度制備5個平行樣品，重復(fù)3個批次，準(zhǔn)確度和精密度見表2。結(jié)果表明，實(shí)際樣品的批內(nèi)和批間回收率為75.6%~91.4%，批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9%。說明本方法準(zhǔn)確度和精密度良好，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求[19]，適用于各類飼料中福莫特羅和阿福特羅總量的定性和定量檢測。

表2 方法的加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果

2.5 方法的應(yīng)用

用本方法對四川省內(nèi)生產(chǎn)環(huán)節(jié)和使用環(huán)節(jié)中的各類飼料產(chǎn)品進(jìn)行福莫特羅和阿福特羅的測定。地域涵蓋四川省東、西、南、北部8個地級市的飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖場戶共計(jì)68份樣品，測定結(jié)果均是未檢出。原因可能是采集到的飼料中未添加福莫特羅和阿福特羅，但不排除養(yǎng)殖場戶為追求高額利潤，通過其他途徑違規(guī)使用，例如飲水、肌肉注射或小范圍拌料。因此，可通過增加監(jiān)測范圍和樣本數(shù)量，擴(kuò)大采樣途徑，從而更加科學(xué)系統(tǒng)地評價飼料中福莫特羅和阿福特羅的風(fēng)險(xiǎn)隱患。

3 結(jié)論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室普遍采用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱建立了一種靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度良好的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定飼料中福莫特羅和阿福特羅總量的方法。樣品提取液有機(jī)相含量低，減少了對操作人員的傷害，步驟科學(xué)合理，易于操作，使用內(nèi)標(biāo)法定量，增強(qiáng)了方法的準(zhǔn)確性，為保障飼料及食品質(zhì)量安全具有重要意義，值得推廣和借鑒。