強(qiáng)婷婷,白露超

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

景天科多肉植物又稱(chēng)多肉花卉或多水植物，其營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)肥大多汁，可儲(chǔ)備大量水分和養(yǎng)分，耐旱、耐高溫能力強(qiáng)[1-2]，外形小巧可愛(ài)，色彩斑斕，廣受年輕人喜愛(ài)。景天科多肉植物已報(bào)道的病害有黑腐病[3-4]、細(xì)菌性褐腐病[5]、白粉病[6]等，白粉病的發(fā)生較為常見(jiàn)。白粉菌是一類(lèi)分布廣泛，對(duì)溫度和濕度適應(yīng)范圍廣，專(zhuān)性寄生于林木、花卉、蔬菜等植物表面，能產(chǎn)生白色至灰白色粉層的病原真菌，主要侵染植物的地上部分。一般情況下，下部葉片較上部葉片易侵染，發(fā)病后期，整個(gè)葉片布滿白色粉層且散生黑色小點(diǎn)。病菌以菌絲體或閉囊殼在病葉上越冬。目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的白粉菌有872種、47個(gè)變種，其中包含16個(gè)有性屬和11個(gè)無(wú)性屬[7-8]。白粉菌的寄主包括44目169科1 617屬9 838種被子植物，其中9 176種為雙子葉植物，662種為單子葉植物[9-11]。

目前對(duì)景天科多肉植物的研究多集中于繁殖栽培、引種栽培和景觀應(yīng)用等方面[12-13]，國(guó)內(nèi)關(guān)于景天科多肉植物病害病原菌鑒定的報(bào)道較少。已報(bào)道的有多肉植物彩虹黑腐病病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[3]；多肉植物翡翠景天黑腐病病原菌為山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)[4]；進(jìn)境多肉植物細(xì)菌性褐腐病病原菌為菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)[5]；內(nèi)蒙古景天科植物白八寶(Hylotelephiumpallescens)和費(fèi)菜(Phedimusaizoon)白粉病病原菌均為景天白粉菌(Erysiphesedi)[6]。引起景天科多肉植物白粉病的病原菌有E.sedi、E.umbilici、Golovinomycesorontii、Podosphaeraxanthii、Oidiumsub.Pseudoidium等，其中景天白粉菌的寄主有很多種，包括景天科的八寶屬(Hylotelephiumsp.)、景天屬(Sedunsp.)、伽藍(lán)菜屬(Kalanchoesp.)[14-15]、落地生根屬(Bryophyllumsp.)[16]和瓦松屬(Orostachyssp.)[17]等植物?，F(xiàn)階段關(guān)于高海拔地區(qū)景天科多肉植物病害特性及病原種類(lèi)的研究尚缺。鑒于此，本研究采集青海西寧景天科不同種類(lèi)多肉植物白粉病病株，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)，鑒定7種景天科多肉植物白粉病的病原，為景天科多肉植物白粉病發(fā)生規(guī)律和綜合防治的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

2018—2019年，在青海省西寧市人民公園和青海大學(xué)附近花卉市場(chǎng)采集7種發(fā)病的景天科多肉植物葉片(圖1)。采集過(guò)程中，將具有白粉病癥狀且粉層較薄的葉片，剪成約0.5 cm×0.5 cm的方塊，放入4%戊二醛固定液中保存，以備掃描電鏡觀察。

1.2 病原菌致病性測(cè)定

依據(jù)柯赫氏法則，采用孢子懸浮液噴霧法對(duì)健康植株進(jìn)行回接。收集植株病葉表面的孢子，配成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，均勻噴灑于健康葉片正反面，并以噴灑無(wú)菌水作對(duì)照，(25±2) ℃下培養(yǎng)。每天噴施無(wú)菌水進(jìn)行保濕，5 d后觀察植株葉片的癥狀，收集病原菌進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)的鑒定[18]。

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

用解剖針挑取成熟的閉囊殼或無(wú)性繁殖體(分生孢子)制作臨時(shí)玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察閉囊殼、子囊、子囊孢子的形態(tài)特征并進(jìn)行描述及拍照；利用掃描電鏡對(duì)無(wú)性型白粉菌的分生孢子、分生孢子梗的形狀等超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察及拍照[19]。根據(jù)觀察和測(cè)定的結(jié)果，參照白粉病菌鑒定特征[13，20-21]，確定景天科多肉植物白粉病的病原菌。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 白粉菌DNA的提取

DNA提取的方法主要是按照Hirata and Takamatsu方法[22]略做改進(jìn)：滴滅菌水于載玻片，在體視鏡下用解剖針挑取零散且無(wú)葉片組織的30個(gè)或以上的閉囊殼，蓋上蓋玻片并輕輕按壓研磨，至閉囊殼全部破碎；吸取50 μL 5%Chelex-100，與已磨碎的閉囊殼混勻并轉(zhuǎn)移混合液于1.5 mL的離心管，離心1 min(12 000r/min)；置于56 ℃水浴鍋中水浴20 min，離心1 min(12 000r/min)；置于92～97 ℃水浴鍋中水浴8 min，離心1 min(12 000r/min)；置于4 ℃或-20 ℃冰箱以備用。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

利用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/P3(5′-GCCGCTTCACTCGCCGTTAC-3′)對(duì)病原菌rDNA-ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[23]。反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 1 μL，引物各1 μL，2× Bios Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，54～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min；4 ℃保存。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建及序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在 NCBI 的 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 序列同源性分析；利用MEGA 5.2軟件以鄰接法(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并分析其親緣關(guān)系，確定病原菌的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

景天科多肉植物白粉病病原菌主要侵染植物葉片的正反面(圖1)，發(fā)病初期葉片出現(xiàn)白色近圓形或不規(guī)則的小粉斑，后蔓延形成白色片狀或邊緣不整齊的塊狀斑，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)葉片覆蓋灰白色粉層(菌絲體、分生孢子和分生孢子梗)，其上散生若干褐色至黑色的小點(diǎn)，為閉囊殼(圖1a)，后期發(fā)病葉片出現(xiàn)褪綠、黃化和皺縮的現(xiàn)象，有些葉片背面較葉片正面發(fā)病明顯，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株植物死亡(圖1h)。

a 凹葉景天(Sedum emarginatum)；b 八寶景天(Hylotelephium erythrostictum)；c 養(yǎng)老石蓮(Echeveria peacockii Baker)； d 露娜蓮(Echeveria Lola)；e 火祭(Crassula capitella)；f 紫珍珠(Echeveria 'Perle von Nürnberg)； g 圣誕伽藍(lán)菜(Kalanchoe blossfeldiana Poelln)；h 火祭整株死亡。圖1 不同景天科多肉植物白粉病癥狀Fig.1 Symptoms of powdery mildew of different Crassulaceae succulents

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

接種5 d后，處理植物開(kāi)始發(fā)病，出現(xiàn)白色粉狀物。接種15 d左右，大部分葉片具有白色粉斑，對(duì)照組植株無(wú)明顯變化。依照柯赫氏法則，用解剖針挑取病斑上的粉層用光學(xué)顯微鏡觀察，觀察到菌絲體的特征均與所采集的發(fā)病葉片上觀察到的結(jié)果一致。說(shuō)明挑取的病原物為景天科多肉植物白粉病的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)特征

選取凹葉景天白粉病病原菌進(jìn)行鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)特征。如圖2a所示，閉囊殼聚生或散生，易生長(zhǎng)于菌絲層內(nèi)，暗褐色至黑色，近球形或扁球形，直徑95～115 μm，壁細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形；附屬絲5～18根，絲狀，直或稍彎曲，不分枝，長(zhǎng)35～195 μm，為閉囊殼直徑的0.3～2.3倍，上下等粗或頂端略細(xì)，具有0～5隔膜，全長(zhǎng)褐色或基部褐色，向上漸無(wú)色；子囊3～5個(gè)，卵形或長(zhǎng)卵形，無(wú)色，有短柄或無(wú)柄，50～75 μm×35～52.5 μm；如圖2b所示，子囊孢子3～5個(gè)，長(zhǎng)卵形或橢圓形，11.5～19.5 μm×8.4～14.5 μm；分生孢子梗直立或稍彎曲(圖2c)，分生孢子單生，長(zhǎng)筒柱形或長(zhǎng)橢圓形。

a 閉囊殼與附屬絲；b 子囊和子囊孢子；c 分生孢子梗與分生孢子。圖2 凹葉景天白粉病病原菌的鏡檢情況Fig.2 Microscopic examination of the pathogen of powdery mildew in Sedum emarginatum

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，并將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得ITS序列登錄號(hào)為MT659927、MT659928、MT659929、MT659930、MT659931、MT659932、MT659933。利用MEGA5.2構(gòu)建病原菌rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，結(jié)果顯示7種景天科多肉植物的病原菌與八寶屬(Hylotelephiumsp.)(JX173289)、景天屬(Sedumsp.)(JX173290)和伽藍(lán)菜屬(Kalanchoesp.)(MT568632)白粉病的病原菌聚在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最為接近，但與同屬的其他白粉菌親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步證實(shí)了景天白粉菌(E.sedi)為7種景天科多肉植物白粉病的病原菌。

圖3 基于rDNA-ITS基因序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 N-J phylogenetic tree contructed based on rDNA-ITS gene sequence

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)7種景天科多肉植物白粉病病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定,得到的形態(tài)學(xué)特征與已報(bào)道的景天白粉菌(E.sedi)一致，且對(duì)病原菌rDNA-ITS基因序列分析也表明二者具有極高的同源性。由此確定引起景天科多肉植物白粉病的病原為景天白粉菌(E.sedi)，屬子囊菌門(mén)(Ascomycetes)白粉菌目(Erysiphales)白粉菌科(Erysiphaceae)。劉鐵志[6]報(bào)道引起內(nèi)蒙古景天科植物白八寶(H.pallescens)和費(fèi)菜(S.aizoon)白粉病的病原菌及方治豪等[24]報(bào)道引起新疆長(zhǎng)藥八寶白粉病的病原菌均為景天白粉菌(E.sedi)。由此可知，景天白粉菌是景天科多肉植物致病的重要病原菌之一。

本研究進(jìn)行了景天科多肉植物白粉病病原菌的鑒定，明確了青海地區(qū)7種景天科多肉植物白粉病的病原，研究結(jié)果可為日后該地區(qū)景天白粉病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)，為有效控制病害的擴(kuò)展和蔓延奠定基礎(chǔ)。