何 宇，賈繼東,b，王 萍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 a.肝病中心，b.北京市臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(glucocorticoid-induced TNF receptor-related protein,GITR/TNFRSF18)屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族，由Nocentini等[1]于1997年從地塞米松處理的T淋巴細(xì)胞雜交瘤中發(fā)現(xiàn)，隨后于1999年和2003年分別從人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞[2]和小鼠脾細(xì)胞[3]中克隆出了能與GITR特異性結(jié)合的GITR配體(GITR ligand,GITRL/TNFSF18)。作為重要的T淋巴細(xì)胞協(xié)同刺激分子，GITRL/GITR主要通過活化效應(yīng)T淋巴細(xì)胞與調(diào)控調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)參與炎癥介導(dǎo)的疾病發(fā)生與進(jìn)展過程，干預(yù)GITRL/GITR通路具有清除病毒與寄生蟲感染、增強(qiáng)抗腫瘤治療效果的作用，因而成為了備受關(guān)注的免疫分子。本文將對GITRL/GITR的生物學(xué)特性與其在肝病研究中的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 GITRL/GITR的分子結(jié)構(gòu)與表達(dá)特點(diǎn)

人GITRL基因位于染色體1q25.1，編碼由177個(gè)氨基酸組成、分子量為20 kD的跨膜蛋白，包含胞內(nèi)段(28個(gè)氨基酸)、跨膜結(jié)構(gòu)域(21個(gè)氨基酸)、胞外段(128個(gè)氨基酸)三部分[2]。GITRL主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞等[4-5]。

人GITR基因位于染色體1p36.33，編碼由228氨基酸組成、分子量為26 kD的跨膜蛋白，包含胞內(nèi)段(58個(gè)氨基酸)、跨膜段(21個(gè)氨基酸)和胞外段(137個(gè)氨基酸)三部分[2]。其胞內(nèi)段與其他TNF家族成員一樣均可募集TNF受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factor，TRAF)傳遞下游信號，但不具有其他TNF家族成員共有的凋亡結(jié)構(gòu)域。GITR主要表達(dá)于胸腺、脾和淋巴結(jié)中的T淋巴細(xì)胞[1]，在小鼠中GITR持續(xù)高表達(dá)于Treg，盡管靜息狀態(tài)的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中GITR表達(dá)水平很低，但這些細(xì)胞活化后GITR表達(dá)顯著增加[6]。

2 GITRL作為協(xié)同刺激信號通過GITR影響免疫細(xì)胞的功能

GITRL可以直接與GITR特異性結(jié)合，也可以被酶切后形成可溶性胞外段與GITR特異性結(jié)合。GITRL/GITR作為協(xié)同刺激信號主要影響T淋巴細(xì)胞，不僅具有促進(jìn)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖與細(xì)胞因子分泌的作用，同時(shí)還具有調(diào)控Treg增殖和抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞功能的作用，從而發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)T淋巴細(xì)胞功能的作用。GITRL/GITR配體-受體信號影響免疫細(xì)胞的作用與功能見表1，本文將對其作用于T淋巴細(xì)胞，主要是效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、Treg和輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)，進(jìn)行重點(diǎn)討論。

表1 GITRL/GITR配體-受體信號在不同的免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)和功能

2.1 GITRL/GITR作為協(xié)同刺激分子活化效應(yīng)T淋巴細(xì)胞發(fā)揮促炎作用 效應(yīng)T淋巴細(xì)胞靜息狀態(tài)GITR表達(dá)水平很低，經(jīng)T淋巴細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)活化后或CD28刺激后GITR表達(dá)顯著增加[6-7]。GITR不僅可以被表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞表面的GITRL所激活，還可以被GITR抗體、可溶性GITRL或通過轉(zhuǎn)染GITRL過表達(dá)質(zhì)粒等方式所活化。對于經(jīng)典的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，活化GITR發(fā)揮共刺激作用促進(jìn)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的存活、活化與增殖[8]。如果單獨(dú)應(yīng)用GITR抗體激活GITR并不能促進(jìn)CD4+CD25-效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的增殖，但如果聯(lián)合應(yīng)用CD3抗體和GITR抗體進(jìn)行刺激，較單獨(dú)應(yīng)用CD3抗體時(shí)，CD4+CD25-效應(yīng)T淋巴細(xì)胞ERK磷酸化水平進(jìn)一步升高，細(xì)胞增殖能力進(jìn)一步增加，炎癥因子IL-2與IFNγ表達(dá)進(jìn)一步增多，并且抑制CD3抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8-9]。應(yīng)用人CD19啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)B淋巴細(xì)胞過表達(dá)GITRL的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究[10]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的GITRL具有活化GITR并刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的作用。應(yīng)用GITR-/-CD8+T淋巴細(xì)胞的研究[11-12]也發(fā)現(xiàn)，GITR作為協(xié)同刺激分子通過TRAF2和TRAF5調(diào)控NF-κB/BCL-XL通路參與CD8+T淋巴細(xì)胞的活化與增殖過程。但對于CD28共刺激分子的應(yīng)答過程，GITR在CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的作用卻明顯不同：GITR直接參與了CD8+T淋巴細(xì)胞對CD28刺激的應(yīng)答，并降低CD8+T淋巴細(xì)胞活化的閾值，而GITR不影響CD4+T淋巴細(xì)胞對CD28的應(yīng)答過程[11]。

2.2 GITRL/GITR影響Treg細(xì)胞的增殖與功能調(diào)控過程 與效應(yīng)T淋巴細(xì)胞靜息狀態(tài)低表達(dá)GITR，而活化后高表達(dá)GITR不同，Treg特征性高表達(dá)GITR[4-5]，Treg活化后、抑制抗原受體信號基因Ptpn22表達(dá)后或在腫瘤微環(huán)境中GITR表達(dá)進(jìn)一步升高[13-15]。作為共刺激信號，GITRL/GITR參與了Treg前體細(xì)胞在胸腺中的成熟分化過程和Treg的增殖與功能調(diào)控過程。

在胸腺中，Treg前體細(xì)胞高表達(dá)GITR和OX40，而胸腺抗原遞呈細(xì)胞(如DC)表達(dá)GITRL和OX40L，GITRL/GITR與OX40L/OX40的共刺激作用增加Treg前體細(xì)胞對IL-2R的敏感性和轉(zhuǎn)錄因子STAT5活化，促進(jìn)FoxP3表達(dá)與Treg前體細(xì)胞成熟分化為Treg，敲除GITR后能夠阻斷Treg在胸腺中的發(fā)育過程[16]。

在Treg功能調(diào)控方面，GITRL/GITR信號的功能仍未達(dá)成共識[17]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，GITRL通過直接刺激CD4+FoxP3+Treg增殖而使其數(shù)量顯著增多，且這些細(xì)胞處于表型活化狀態(tài)并具有抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的功能。應(yīng)用MHC-Ⅱ+啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)GITRL的轉(zhuǎn)基因小鼠研究[18]發(fā)現(xiàn)，Treg數(shù)量增加了5倍，而且具有抑制原始T淋巴細(xì)胞增殖作用的FoxP-IL-10+的Ⅰ型調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加。上述結(jié)果提示，GITRL/GITR信號作用于Treg可促進(jìn)其增殖，增強(qiáng)其免疫抑制功能。

然而，應(yīng)用GITR特異性激活抗體DTA-1處理BALB/c小鼠3周后(每周1次)，盡管效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和Treg數(shù)量沒有明顯變化，但可抑制Treg的免疫抑制功能，誘發(fā)自身免疫性疾病[6,19]。GITR特異性激活抗體DTA-1也可以降低腫瘤浸潤Treg的數(shù)量及其抑制功能，增強(qiáng)腫瘤殺傷性CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞的作用，進(jìn)而打破腫瘤中Treg形成的免疫抑制性微環(huán)境，發(fā)揮抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用[20-21]。

2.3 GITRL/GITR信號對Th的調(diào)控作用 近年發(fā)現(xiàn)GITRL/GITR信號亦參與了Th(包括Th17、Tfh和Th9)的形成、增殖與功能調(diào)控過程。GITRL可誘導(dǎo)原始CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)RORγt，并促進(jìn)Th17的增殖，應(yīng)用GITRL處理正常小鼠也可引起脾內(nèi)Th17的擴(kuò)增[19]。在膠原誘導(dǎo)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中和關(guān)節(jié)炎患者中，血清GITRL水平顯著增加，且與疾病嚴(yán)重程度和Th17數(shù)量呈正相關(guān)，應(yīng)用GITRL處理后能夠促進(jìn)Th17擴(kuò)增，進(jìn)一步加重疾病的嚴(yán)重程度[19]。

在膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，CD4+Tfh較非Tfh的GITR表達(dá)水平顯著升高[22]?；罨疓ITR信號可增加Tfh的比例和數(shù)量[22]，調(diào)控Tfh分化(即增加效應(yīng)Tfh與調(diào)節(jié)性Tfh比例)[23]和促進(jìn)T淋巴細(xì)胞依賴性的抗體應(yīng)答過程[24]。缺乏GITR信號或應(yīng)用GITRL/GITR相互作用的競爭性抑制劑GITR-Fc可降低Tfh輔助自身抗體合成功能，降低Tfh應(yīng)答反應(yīng)，減輕自身免疫性疾病的嚴(yán)重程度[22,25]。而GITR激活性抗體DTA-1通過抗原特異性模式經(jīng)IL-4/c-Maf通路增加表達(dá)IL-21的Tfh數(shù)量，增強(qiáng)腫瘤特異性細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能[26]。

GITR激活性抗體DTA-1可以與IL-4協(xié)同，通過TRAF6/NF-κB途徑誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Th9的作用，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)[27]。

3 GITR/ GITRL逆向信號調(diào)控抗原遞呈細(xì)胞功能

表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞等)的GITRL可以被GITR-Fc、可溶性GITR或抗GITRL抗體所活化，由于GITRL具有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，在與GITR結(jié)合后該結(jié)構(gòu)域能夠傳遞逆向信號影響表達(dá)GITRL細(xì)胞的功能[28](表2)。

表2 GITR/GITRL受體-配體逆向信號在抗原遞呈細(xì)胞中的表達(dá)和功能

3.1 GITR/GITRL逆向信號增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)、促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附遷移的作用 GITRL高表達(dá)于人血管內(nèi)皮細(xì)胞，在炎癥情況下IFNα與IFNβ具有進(jìn)一步促進(jìn)其表達(dá)的作用[29]。GITR-Fc活化GITRL可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞STAT1a與STAT1b的磷酸化、增加ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)、促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和遷移[30]。

3.2 GITR/GITRL逆向信號抑制DC的功能 DC既表達(dá)GITR也表達(dá)GITRL，尤其當(dāng)DC處于活化狀態(tài)時(shí)，GITRL表達(dá)進(jìn)一步增加[5]。GITR活化DC的GITRL后可激活NF-κB信號，抑制具有促炎作用的IL-12的表達(dá)[31]，促進(jìn)具有抑炎作用的吲哚胺2,3-二氧化酶表達(dá)[32]，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用，平衡GITR活化T淋巴細(xì)胞的促炎作用。

3.3 GITR/GITRL逆向信號刺激巨噬細(xì)胞聚集和與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的作用 與DC類似，巨噬細(xì)胞既表達(dá)GITR，也表達(dá)GITRL。GITRL抗體或GITR-Fc重組蛋白處理原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系THP-1，活化GITRL通過ERK/NF-κB途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶并上調(diào)ICAM-1的表達(dá)，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集和與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附[33-35]。

4 GITRL/GITR協(xié)同刺激信號在肝臟疾病中的研究進(jìn)展

相對于其他器官、系統(tǒng)的炎癥性疾病，GITRL/GITR在肝臟疾病中的研究還相對較少，目前的研究主要集中于GITRL/GITR調(diào)控效應(yīng)T淋巴細(xì)胞與Treg功能，進(jìn)而影響肝移植術(shù)后、基因治療后的免疫耐受與肝腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸方面。

4.1 GITRL/GITR參與了Kupffer細(xì)胞調(diào)控的肝臟炎癥損傷過程 小鼠腹腔注射脂多糖24 h后，肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，尤其是Kupffer細(xì)胞中，GITRL表達(dá)顯著增加，應(yīng)用GITRL siRNA抑制Kupffer細(xì)胞中GITRL表達(dá)后，促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-6分泌顯著降低，表明GITRL具有促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-6分泌的作用[36]。地塞米松可通過降低Kupffer細(xì)胞中GITRL表達(dá)、減少TNFα和IL-6分泌，進(jìn)而減輕脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷[36]。

4.2 GITRL/GITR參與肝移植術(shù)后的免疫排異過程 異種異體肝移植大鼠研究[37]顯示，Kupffer細(xì)胞GITRL表達(dá)顯著增加，并調(diào)控了肝移植術(shù)后免疫排異反應(yīng)。應(yīng)用肝移植患者術(shù)后血液DNA樣本，經(jīng)焦磷酸測序分析顯示，無慢性免疫排斥反應(yīng)的患者GITRL的甲基化水平顯著低于有免疫排斥反應(yīng)的患者，而GITR基因的甲基化水平無明顯變化[38]。由于GITRL甲基化水平降低對應(yīng)GITRL轉(zhuǎn)錄、表達(dá)增加，提示外周血GITRL表達(dá)增加與肝移植患者術(shù)后免疫排異反應(yīng)密切相關(guān)。目前尚缺乏表達(dá)增加的GITRL如何通過GITR信號調(diào)控Treg與效應(yīng)T淋巴細(xì)胞影響肝移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的研究。

4.3 GITRL/GITR參與Treg調(diào)控的基因治療的免疫耐受過程

在基因治療過程中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物存在被免疫系統(tǒng)識別并清除的風(fēng)險(xiǎn)。在靶向肝臟的基因治療中，肝臟需要產(chǎn)生針對特異外源蛋白的免疫耐受，只有在肝臟微環(huán)境中誘導(dǎo)抗原特異性Treg，并刺激其大量增殖，才能避免外源基因產(chǎn)物被清除，達(dá)到基因治療的目的。AAV8-OVA基因注射后，GITRL-/-小鼠中抗原特異性Treg數(shù)量下降，而抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞顯著增加，表明GITRL是Treg調(diào)節(jié)機(jī)體對外源基因形成免疫耐受所必須的共刺激信號[39]。應(yīng)用人凝血因子Ⅸ基因治療失敗的C3H/HeJ遺傳性出血性疾病小鼠模型，注射GITRL-Fc后，由于GITRL-Fc對Treg的增殖促進(jìn)作用(11倍)顯著高于對效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用(1.5倍)，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫耐受，使得靶向肝臟的人凝血因子Ⅸ基因表達(dá)增加，表明Treg在抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞清除外源基因方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[40-41]。因而，可利用GITRL-Fc參與誘導(dǎo)外源基因特異性Treg，避免外源轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物被免疫細(xì)胞清除，進(jìn)而提高基因治療的效果。

4.4 高表達(dá)GITR的Treg參與了肝腫瘤的免疫逃逸過程

作為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的協(xié)同刺激分子，在腫瘤治療中通過活化GITRL/GITR信號增強(qiáng)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，降低Treg的免疫抑制功能[20]，以達(dá)到治療腫瘤目的，已經(jīng)成為了新的腫瘤免疫治療策略，受到越來越多的研究者關(guān)注。

在慢性乙型肝炎患者(15例)和肝細(xì)胞癌患者(49例)中，外周血Treg和肝臟浸潤Treg數(shù)量顯著增加，且慢性乙型肝炎患者Treg不僅能夠抑制HBV抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，也能夠抑制肝細(xì)胞癌腫瘤抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。與和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HBV基因的HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg數(shù)量更多，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4、GITR表達(dá)水平更高，對腫瘤抗原NY-ESO-1或MAGE-A3誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)有更強(qiáng)的抑制作用[41]，提示GITR可能參與了HBV感染導(dǎo)致的機(jī)體免疫抑制功能增加、抗腫瘤免疫反應(yīng)下降，參與了慢性乙型肝炎到肝細(xì)胞癌的病理發(fā)生過程。

與非腫瘤肝組織相比，肝細(xì)胞癌、膽管癌和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織中，表達(dá)GITR的Treg數(shù)量顯著增加，且這些細(xì)胞抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖的功能也顯著增強(qiáng)[13,42-44]；而效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部數(shù)量較少，多位于腫瘤邊緣[44]，且腫瘤特異性增殖能力與發(fā)揮裂解腫瘤細(xì)胞功能的分子表達(dá)均顯著下降，表明免疫抑制微環(huán)境在肝腫瘤形成過程中發(fā)揮了重要的作用[38,40]。體外應(yīng)用重組GITRL或人源GITR活化抗體，可以刺激從患者腫瘤組織中分離的腫瘤抗原特異性CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)IFNγ和顆粒酶B的分泌，提示GITRL可以提高效應(yīng)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的功能[43-44]。當(dāng)從患者外周血和腫瘤組織中分離的Treg與效應(yīng)T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，GITRL能夠降低Treg對效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的抑制作用[37,39]，提示靶向GITR可以作為一種新的肝細(xì)胞癌免疫治療策略。在Clinical Trial上注冊的4項(xiàng)單獨(dú)應(yīng)用GITR活化抗體治療黑色素瘤、肺癌、腎癌等惡性腫瘤的項(xiàng)目處于Ⅰ期或Ⅱ/Ⅱ期[45]，用于治療肝腫瘤的研究尚未見到相關(guān)的注冊研究項(xiàng)目。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，GITRL/GITR協(xié)同刺激信號在肝移植術(shù)后、基因治療后免疫排異與肝腫瘤的免疫逃逸過程中發(fā)揮了重要的作用，通過干預(yù)GITRL/GITR協(xié)同刺激信號調(diào)控Treg與效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的功能，對于改善肝移植術(shù)后、基因治療后免疫排斥問題和有效殺傷腫瘤細(xì)胞方面都有很好的應(yīng)用前景。但是，目前基于GITRL/GITR協(xié)同刺激信號在其他肝臟疾病發(fā)生和進(jìn)展中作用的研究尚比較少，尤其是在抗感染與改善自身免疫性肝病方面，GITRL/GITR協(xié)同刺激信號是否參與其中、作用機(jī)制怎樣，仍是值得深入研究的問題。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：何宇負(fù)責(zé)收集文獻(xiàn)，分析文獻(xiàn)，撰寫論文；王萍、賈繼東負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。