張耀剛，李建華，侯 靜，孫 莉，田美媛，江 源，黃登亮，張 濤,3，馬艷艷，樊海寧

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 中心實驗室，西寧 810000；2 青海省包蟲病研究重點實驗室，西寧 810000；3 青海大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，西寧 810000

多房棘球絳蟲的幼蟲期是泡型包蟲病(aveolar echinococcosis,AE)的病原體，是一種分布在北半球的寄生性人畜共患疾病，估計每年有17 400例新感染[1-2]。在全球每年AE新發(fā)病例中，91%發(fā)生在中國，某些地區(qū)的人類流行率超過3%[3]。在泡球蚴慢性感染過程中，最初的急性炎癥Th1反應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)化為混合Th1/Th2反應(yīng)[4]。但這種相對簡單的Th1-Th2轉(zhuǎn)變模式已經(jīng)被新的研究不斷修改，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其他T淋巴細胞的亞群也參與到泡球蚴慢性感染過程，如CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴(Treg)細胞和Th17細胞作為Th1和Th2細胞的兩個不同亞群，它們似乎在AE的發(fā)病過程中起著重要的作用[4-5]。新近的報道發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞還有一個獨特的亞群，就是濾泡輔助T淋巴細胞(Tfh)，在調(diào)節(jié)T淋巴細胞依賴性B淋巴細胞反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。這類特殊的輔助性T淋巴細胞定位于生發(fā)中心，其高表達CXCR5、ICOS(inducible T-cell costimulator)、PD-1(programmed death-1)、CD200、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)等表面受體，以及細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl6[6]。生發(fā)中心的形成、B淋巴細胞的分化和抗體親和力成熟過程都離不開Tfh的輔助作用。泡球蚴在宿主內(nèi)的免疫逃避機制是否與Tfh細胞有關(guān)，是很值得探討的問題，因此，本研究初步觀察了多房棘球蚴在AE動物模型中的表達，以了解泡球蚴感染與Tfh細胞的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8～10周齡SD雄性大鼠購買于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCJX(蘇)2017-0001；實驗動物使用許可證編號SYXK(青)2016-0001：動物合格證號：2019186104。用于泡球蚴保種的蒙古長爪沙鼠來源于青海省包蟲病研究重點實驗室。

1.2 儀器試劑 BD FACSCelest流式細胞儀，CoraLite?647-Conjugated PD-1(Proteintech，CL647-66220)，Anti-CXCR5抗體 (Alexa Fluor?488)(ABcam,ab223980)，Mouse Anti-Rat CD4(BD,551397)，Lysing Buffer(BD,555899)。

1.3 動物造模 將1只成功感染泡球蚴的長爪沙鼠斷頸處死后分離原頭節(jié)，使用0.04%臺盼藍檢查原頭節(jié)活性。實驗大鼠隨機分為正常對照組和模型組，每組10只。對照組不做任何處理，模型組用10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉,碘伏消毒上腹部皮膚,開腹約0.5 cm，直視下7 號針頭右肝葉穿刺，注入泡球蚴混懸液(約2000個具有活性的原頭節(jié))，然后用可吸收手術(shù)縫合線縫合腹部肌肉及皮膚。3個月后，用10%水合氯醛0.3 ml/100 g 麻醉SD大鼠后，開腹暴露下腔靜脈，用含EDTA-K2的采血管保存血液。斷頸處死后分離脾臟。

1.4 脾臟單細胞懸液的制備 稱取0.1 g的脾臟組織，在300目的鋼網(wǎng)上研磨，鋼網(wǎng)下放置35 mm的細胞培養(yǎng)皿收集細胞，邊研磨邊用HBSS緩沖液沖洗，將細胞培養(yǎng)皿中的液體用300目的鋼網(wǎng)在過濾一次后，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。混勻后靜置5 min。將最上層2 ml去掉，吸取1 ml細胞懸液轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，1000 r/min 離心5 min，小心吸掉上清。加入1 ml紅細胞裂解液，混勻后，冰上靜置15 min，1000 r/min 離心5 min，小心吸掉上清，加入1 ml HBSS緩沖液懸浮細胞后，450 g/min 離心5 min，吸掉上清，加入1 ml HBSS緩沖液懸浮細胞，并計數(shù)。每個流式管分裝1×106個細胞。用HBSS緩沖液將體積定容為100 μl。

1.5 PBMC細胞懸液的制備及熒光抗體孵育 依照血常規(guī)結(jié)果，計算每個檢測管WBC的數(shù)目為1×106個細胞，將血液分裝于流式檢測管中，每組設(shè)置blank管和三色熒光標(biāo)記管，以CD4+CXCR5+PD1+為Tfh細胞的標(biāo)記。每管加入CD4-PE 5 μl，CXCR5-488 2 μl，PD1-Alexa Fluor 647 1 μl，旋渦混勻，室溫避光孵育20 min，加入1 ml紅細胞裂解液，旋渦混勻冰上靜置15 min，1000 rpm/min 離心5 min，小心吸掉上清，加入1 ml HBSS緩沖液懸浮細胞后，450 g/min離心5 min，吸掉上清，重復(fù)3次，洗去紅細胞，加入300 μl HBSS緩沖液懸浮細胞，上機檢測。脾臟細胞熒光抗體孵育步驟與PBMC細胞類似。

1.6 倫理學(xué)審查 本研究所用實驗動物均按照青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會的指導(dǎo)原則接受人道護理，動物操作規(guī)程經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會批準，批號：P-SL-2019033。所有手術(shù)均在水合氯醛麻醉下進行，并盡一切努力減少痛苦。

2 結(jié)果

2.1 模型建造情況 造模3個月后，大鼠肝臟上長出明顯病灶(圖1a)，病灶中可見較多原頭節(jié)(圖1b)。

注：a,感染多房棘球蚴3個月后，SD大鼠肝臟病灶情況；b,病灶HE染色結(jié)果(×100)。圖1 模型建造情況

2.2 Tfh細胞在AE模型鼠外周血中的表達情況 感染泡球蚴3個月后，模型組大鼠外周血中CD4+CXCR5+PD1+Tfh細胞在CD4+細胞中的平均占比相較于正常對照組明顯升高(t=10.230，P<0.001)，在所有細胞中CD4+CXCR5+PD1+Tfh細胞所占的比例低于正常對照組(t=5.520，P<0.001)(表1,圖2)。

表1 AE模型鼠外周血中Tfh細胞表達情況

注：空白組，未標(biāo)記熒光抗體用于流式細胞術(shù)圈門設(shè)定界限的組；a、d、g,外周血中淋巴細胞；b、e、h,CD4+細胞；c、f、i，CD4+中CXCR5和PD1陽性細胞，其中Q2門表示CD4+CXCR5+PD1+Tfh細胞。圖2 AE模型鼠外周血中Tfh細胞的流式細胞檢測結(jié)果

2.3 Tfh細胞在AE大鼠模型脾臟中的表達情況 感染泡球蚴3個月后，模型鼠脾臟中Tfh細胞在所有細胞中百分比高于正常對照組(t=4.769，P<0.001)(表2,圖3 )。

表2 AE模型鼠脾臟中Tfh細胞表達情況

注：a、d、g,目的細胞群；b、e、h,CD4+細胞；c、f、i,CD4+中CXCR5和PD1陽性細胞,其中Q2門表示CD4+CXCR5+PD1+Tfh細胞。圖3 AE模型鼠脾臟中Tfh細胞的流式細胞檢測結(jié)果

3 討論

盡管Tfh的功能早在1980年就已眾所周知，但直到2009年人們才認識到其屬于CD4+T淋巴細胞亞群，最早在人的扁桃體中被發(fā)現(xiàn)。它們在保護性免疫中起關(guān)鍵作用，協(xié)助B淋巴細胞產(chǎn)生針對外源病原體的抗體。Tfh細胞位于次級淋巴器官，包括扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)，與B淋巴細胞緊密互動[7-9]。除此之外，在循環(huán)系統(tǒng)中也可以發(fā)現(xiàn)Tfh細胞。Tfh細胞對免疫系統(tǒng)的建立以及功能的完善非常重要，特別是針對感染疾病的體液免疫起決定性調(diào)節(jié)作用，同時在自身免疫和腫瘤發(fā)生等相關(guān)疾病中也扮演重要角色。其特殊之處在于，它沒有溶解細胞或吞噬細胞的作用，但卻可以激活并指導(dǎo)其他免疫細胞[10]。

在許多抗體產(chǎn)生過多或不足的疾病中，Tfh功能已顯示出功能失調(diào)。血液循環(huán)中的Tfh細胞數(shù)已表明自身免疫性疾病(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)患者血液中Tfh數(shù)量的增加。由ICOS缺乏引起的常見免疫缺陷患者已出現(xiàn)循環(huán)Tfh嚴重降低和抗體生成方面的缺陷[11-13]。如目前發(fā)現(xiàn)在HIV感染中Tfh細胞功能可能存在缺陷。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，HIV患者Tfh細胞明顯增多，體內(nèi)廣譜中和性抗體量卻極少，并且從HIV感染患者體內(nèi)分離的Tfh細胞，其IL-21的分泌明顯減少，無法給予B淋巴細胞所需信號，說明 HIV患者的Tfh存有極大缺陷[16-17]。

最近的證據(jù)[18]表明，瘧原蟲感染能夠使CD4+T淋巴細胞偏向于向主要產(chǎn)生IFNγ的Th1細胞轉(zhuǎn)變，從而影響Tfh細胞的分化，導(dǎo)致B淋巴細胞對瘧原蟲反應(yīng)降低。泡球蚴進入宿主機體后會引起復(fù)雜的免疫反應(yīng)，最終引起免疫逃避。首先參與抗蟲免疫的是固有免疫系統(tǒng)的細胞，但樹突狀細胞和巨噬細胞不是泡球蚴實現(xiàn)免疫逃避調(diào)節(jié)期功能的唯一目標(biāo)。內(nèi)皮細胞(在皮膚、肺、腸和肝中)也可以被誘導(dǎo)表達和分泌抗炎介質(zhì)，如IL-10和前列腺素[19]。這樣，寄生蟲不僅減少了被消滅的可能性，還能最大限度地減少局部宿主組織的損傷。通過誘導(dǎo)樹突狀細胞和巨噬細胞的功能變化，進而引起T淋巴細胞功能的轉(zhuǎn)變[4]。

泡球蚴與棘球蚴具有較高的同源性，但感染機體后引起機體的反應(yīng)卻存在較大差異，棘球蚴感染人體后可被宿主產(chǎn)生的纖維外囊包裹，而泡球蚴感染宿主后呈侵潤性生長[20-21]。泡球蚴感染早期引起的宿主免疫應(yīng)答以Th1類為主，3個月后則轉(zhuǎn)為以Th2類為主[5]。丁劍兵教授團隊[22]研究細粒棘球蚴患者術(shù)前術(shù)后外周血Tfh細胞發(fā)現(xiàn)，囊型包蟲病患者術(shù)前外周血中Tfh細胞比例明顯高于對照組，且術(shù)后Tfh細胞明顯下降，提示Tfh細胞參與了棘球蚴的感染。本研究也發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染SD大鼠3個月之后，外周血Tfh細胞較正常組明顯升高。但Tfh細胞在脾臟CD4+T淋巴細胞中所占比例并沒有升高，并且無論是外周血還是脾臟中，泡球蚴感染后Tfh細胞在單個核細胞或脾臟細胞中的百分比是降低的，提示泡球蚴感染3個月后，宿主免疫細胞可能減少。

本研究初步研究了Tfh細胞在泡球蚴感染后的變化，今后將進一步深入動態(tài)的分析Tfh細胞在泡球蚴感染引起宿主免疫功能調(diào)節(jié)，以適應(yīng)自身生存中的作用，為揭示泡球蚴在宿主體內(nèi)的免疫逃避機制提供參考。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：馬艷艷、樊海寧負責(zé)課題設(shè)計，擬定寫作思路；張耀剛、李建華負責(zé)資料分析，撰寫論文；侯靜、孫莉、田美媛、江源、張濤、黃登亮參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；馬艷艷、樊海寧指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。