靳鑫旻，楊通旺 ，徐慶國，劉 歡，關(guān) 鴿，臧運(yùn)金

1 青島大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，山東 青島 266000；2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院 器官移植中心，山東 青島 266000

肝癌作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與致死率在各類腫瘤中一直位居前列[1]。我國每年肝癌新發(fā)病例數(shù)與死亡病例數(shù)約占全球總病例數(shù)的一半[2]，其中肝細(xì)胞癌占絕大多數(shù)，因此本文主要討論肝細(xì)胞癌。肝癌的發(fā)展，除因環(huán)境因素影響外，往往還與基因的突變或異常表達(dá)有關(guān)[3]。由于肝癌具有早期癥狀不明顯、進(jìn)展隱匿等特點(diǎn)，盡管在肝癌發(fā)現(xiàn)后可以進(jìn)行手術(shù)為主的多種治療方法，但總體預(yù)后不佳[4-6]。腫瘤發(fā)生與進(jìn)展的關(guān)鍵在于正常的細(xì)胞周期被破壞，失去分化的能力，最終發(fā)生惡性增殖。因此，可以將抑制肝癌細(xì)胞的惡性增殖、恢復(fù)其正常的細(xì)胞進(jìn)程作為治療肝癌的潛在靶向。

核仁紡錘體相關(guān)蛋白1(nuclelar spindle-associated protein 1,NUSAP1)作為一種微管結(jié)合蛋白，在人體內(nèi)高度保守，其作用在于調(diào)控紡錘體的正確裝配以及染色體的形成，在有絲分裂過程中發(fā)揮不可或缺的作用[7-9]。在正常的組織中，NUSAP1的表達(dá)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，以防止細(xì)胞增殖異常。當(dāng)NUSAP1表達(dá)異常增高時(shí)，會導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程無法終止，引起細(xì)胞的無限增殖以及遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定。現(xiàn)有研究[10-16]已經(jīng)證實(shí)，NUSAP1在多種腫瘤中表達(dá)異常增高，提示其密切參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

生物信息學(xué)分析在近幾年越來越多的用于研究腫瘤進(jìn)展過程中的基因表達(dá)變化[17]。通過對大量共享數(shù)據(jù)的挖掘、分析及解釋，可以方便、快捷地發(fā)現(xiàn)具有表達(dá)差異的基因，找到疾病治療的潛在靶標(biāo)以及預(yù)后評估的可能標(biāo)志物[18]。本研究通過對GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫公共數(shù)據(jù)的整理分析，對NUSAP1在肝癌組織及細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異及其對預(yù)后的影響進(jìn)行了初步的探索。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載肝癌轉(zhuǎn)錄組信息及臨床數(shù)據(jù)，選擇臨床信息完善的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，以剔除腫瘤復(fù)發(fā)類型為非肝癌的R0切除術(shù)后患者的臨床信息評估其預(yù)后。在GEO官網(wǎng)下載GSE57957、GSE14520、GSE22058、GSE46444、GSE54236、GSE36376、GSE64041、GSE76297、GSE76427、GSE102079共10個(gè)種屬為Homo sapiens的肝癌數(shù)據(jù)集。在GEO官網(wǎng)下載單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集GSE149614。選取2018年1月—2019年11月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行同種異體肝移植術(shù)的隨訪信息完善、病理診斷明確、生物樣本取材規(guī)范的乙型肝炎相關(guān)肝癌患者42例，統(tǒng)計(jì)其臨床資料，包括性別、血型、年齡、BMI、血清AFP水平、MELD評分、Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、TNM分期及Okuda分期等。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對選取的42例臨床樣本利用Trizol法提取總RNA，并通過TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用TaKaRa PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量-PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參照，測定NUSAP1相對表達(dá)水平。GAPDH引物序列為：F：5′-CGGGCTCTCCAGAACATC-3′，R：5′-ATGACCTTGCCCACAGCCT-3′；NUSAP1引物序列為F：5′-ACCCTGACTCACAGCAGAATC-3′，R：5′-CAGCTTCTTGGTGCTCGTCT-3′。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：QYFYWZLL26046。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 R 4.0軟件用于所有數(shù)據(jù)集基因表達(dá)差異分析及單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的聚類分析。采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料2組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以Kaplan-Meier方法生存分析NUSAP1表達(dá)水平與總體生存率及無病間隔生存率之間的關(guān)系，運(yùn)用log-rank進(jìn)行檢驗(yàn)，通過Graphpad prim 7使其結(jié)果可視化。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NUSAP1在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 為研究NUSAP1在肝癌組織中的表達(dá)，同時(shí)從GEO和TCGA中下載肝癌和癌旁組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，NUSAP1在10個(gè)GEO肝細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的肝癌組織中高表達(dá)，在TCGA數(shù)據(jù)庫中也呈高表達(dá)(P值均<0.001)(附錄1)。

2.2 NUSAP1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 為避免腫瘤異質(zhì)性對本研究的影響，從GEO中下載了肝細(xì)胞癌的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集GSE149614并進(jìn)行聚類分析。依據(jù)細(xì)胞標(biāo)志物和組織來源的差異，將所有細(xì)胞分為來源于腫瘤組織的細(xì)胞與來源于癌旁組織的細(xì)胞。結(jié)果顯示，來源于腫瘤組織的細(xì)胞其NUSAP1高表達(dá)細(xì)胞明顯高于癌旁組織細(xì)胞(附錄2)。

2.3 NUSAP1在臨床肝癌樣本中的表達(dá) 數(shù)據(jù)庫的測序結(jié)果，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測42例患者肝癌和癌旁組織中NUSAP1的相對表達(dá)。與GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，NUSAP1在29例患者的肝癌組織中高表達(dá)，在13例患者的肝癌組織中低表達(dá)(P=0.003)(圖1)。

圖1 NUSAP1在臨床肝癌樣本中高表達(dá)

2.4 NUSAP1表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

NUSAP1在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)組及低表達(dá)組間，Child-Pugh分級、TNM分期、Okuda分期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1),表明NUSAP1的表達(dá)水平與肝癌患者的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

表1 NUSAP1表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 NUSAP1在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 NUSAP1高表達(dá)的肝癌患者總體生存率與無病間隔生存率均顯著低于低表達(dá)的肝癌患者(圖2)，NUSAP1低表達(dá)患者1、3、5年生存率分別為92.96%、83.80%、76.76%，明顯高于高表達(dá)的患者(76.76%、67.60%、64.78%)(χ2值分別為8.156、7.853、7.671,P值均<0.05)，NUSAP1高表達(dá)的患者中位生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)的患者(61.7 個(gè)月 vs 108.6個(gè)月)(χ2=7.955,P<0.05)。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中NUSAP1與總體生存率及無病間隔生存率之間的關(guān)系

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，有多種細(xì)胞參與肝癌的發(fā)生與進(jìn)展[19]。肝癌因其惡性程度高、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，常見的治療手段并不能顯著改善肝癌患者的生存時(shí)間[20]。遺傳因素作為限制肝癌患者預(yù)后的重要因素持續(xù)受到人們的關(guān)注。相比于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展以及腫瘤基因數(shù)據(jù)的共享，使得腫瘤相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)周期大為縮短，為研究肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探尋潛在治療靶點(diǎn)提供了重大便利。

NUSAP1作為有絲分裂中的一種關(guān)鍵蛋白，通過參與有絲分裂中紡錘體的形成得以調(diào)控細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，一旦NUSAP1表達(dá)異常升高，細(xì)胞

將無限增殖，甚至影響遺傳物質(zhì)[9]。已有研究[14-15]證實(shí)，NUSAP1在多種腫瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞癌、腎癌、乳腺癌等)中表達(dá)均顯著提高，且均與預(yù)后有關(guān)，可以作為該型腫瘤的潛在標(biāo)志物。本研究通過對大量GEO芯片數(shù)據(jù)及TCGA數(shù)據(jù)集的分析，證實(shí)NUSAP1在肝癌組織中的表達(dá)明顯升高。通過對單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的分析，使NUSAP1高表達(dá)的肝癌細(xì)胞來源于肝癌組織中的推論更為明確，進(jìn)一步證實(shí)肝癌細(xì)胞的無限增殖與NUSAP1表達(dá)升高的關(guān)系。由此推斷，在肝臟因遺傳因素或外界理化因素刺激后，NUSAP1表達(dá)出現(xiàn)異常增高，使肝細(xì)胞持續(xù)增殖，最終誘導(dǎo)癌變的產(chǎn)生。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中患者預(yù)后信息的分析發(fā)現(xiàn)，NUSAP1的表達(dá)水平明顯影響患者的預(yù)后，高表達(dá)組的患者總體生存率、無病間隔生存率均顯著低于低表達(dá)組。進(jìn)一步臨床資料分析證實(shí)了上述結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)NUSAP1在肝癌中的表達(dá)水平與Child-Pugh分級、TNM分期、Okuda分期顯著相關(guān)，表明NUSAP1的表達(dá)升高使得腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，使肝癌進(jìn)展迅速，患者病情惡化加快，從而影響預(yù)后。綜上所述，NUSAP1可以作為肝癌不良預(yù)后的新標(biāo)志物并可以成為肝癌治療的潛在新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究將高通量基因芯片數(shù)據(jù)、單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的分析與現(xiàn)有臨床樣本PCR驗(yàn)證相結(jié)合，避免了單一研究方式的不足，結(jié)論更有說服力。研究驗(yàn)證了NUSAP1在肝癌細(xì)胞中的異常表達(dá)升高且與患者預(yù)后相關(guān)，為肝癌的靶向用藥提供了新的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：靳鑫旻、楊通旺、徐慶國負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；靳鑫旻、劉歡、關(guān)鴿參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；臧運(yùn)金等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

附錄1見二維碼

附錄2見二維碼