任婷玉，聶赫中容 ,肖利佳，林芳楠，王大明，宋春麗，周義文

1 南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518000；2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院 基因診斷中心，長(zhǎng)春 130012

HBV的持續(xù)感染是導(dǎo)致肝炎肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生最主要的因素之一[1]。慢性HBV感染者比未感染者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)高25～37倍[2]。部分HBV感染者將經(jīng)歷漫長(zhǎng)的肝細(xì)胞損傷，修復(fù)，再損傷，進(jìn)而發(fā)生肝纖維化，如不及時(shí)干預(yù)，最終可能在肝硬化的基礎(chǔ)上進(jìn)展為肝細(xì)胞癌[3]。肝星狀細(xì)胞(HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細(xì)胞[4]。正常情況下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí)，HSC被激活。肝細(xì)胞是肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，占肝臟細(xì)胞數(shù)量的80%，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的疾病通常會(huì)引起肝實(shí)質(zhì)損傷以及肝臟微環(huán)境的改變，直接或間接地促進(jìn)HSC活化[5]。

本研究擬通過應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的LO2細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基干預(yù)人HSC系LX-2來模擬HBV感染肝細(xì)胞的狀態(tài)，探索HBV感染的肝細(xì)胞對(duì)HSC活化和增殖的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集2020年11月— 2021年1月在南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院診斷為慢性乙型肝炎患者血漿30份、乙型肝炎肝硬化患者血漿42份、肝細(xì)胞癌患者血漿30份及同期在本院體檢的健康人群血漿18份。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 人HSC株LX-2、人肝細(xì)胞株LO2(中科院上海細(xì)胞庫)；HBx過表達(dá)和對(duì)照慢病毒(廣州萊德爾生物)；培養(yǎng)基及胎牛血清(美國(guó)Gibco)；鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、鼠抗人α1-Ⅰ型膠原(Col1A1)、鼠抗人GAPDH抗體均為美國(guó)Proteintech公司生產(chǎn)；HBV X蛋白抗體(英國(guó)Abcam)；CCK-8檢測(cè)試劑(日本同仁)；逆轉(zhuǎn)錄(美國(guó)ThermoFisher)；熒光定量PCR試劑(天根生物)；TGFβ1、HBxAg、多巴胺β羥化酶(DBH)和Hyp酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物)；細(xì)胞因子TGFβ1(美國(guó)Peprotech)，TGFβ1受體抑制劑SB-431542(美國(guó)Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LO2細(xì)胞采用RP-MI1640培養(yǎng)基，LX-2采用DMEM培養(yǎng)基,分別添加10%胎牛血清、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素，培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)取用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建 將貼壁細(xì)胞以1×105/孔鋪到24孔板中。在細(xì)胞培養(yǎng)貼壁18～24 h后，吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，加入1 ml新鮮培養(yǎng)基(含40 μl HitrasG P)。以MOI=50加入病毒。搖勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中感染12～16 h。第2天(12～16 h后)用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察熒光表達(dá)。在完全培養(yǎng)基中加入終濃度為1 μg/ml的puro，替換原來的培養(yǎng)基[LO2細(xì)胞分為L(zhǎng)O2-HBx組(穩(wěn)定表達(dá)HBx)、陰性對(duì)照組(LO2-con)、空白組(正常培養(yǎng)的不轉(zhuǎn)病毒的LO2細(xì)胞，Mock)]。每天換含puro的完全培養(yǎng)液1次，直到正常培養(yǎng)組細(xì)胞被puro殺光。將獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株擴(kuò)大傳代培養(yǎng)，并凍存。

1.2.3 制備條件培養(yǎng)基培養(yǎng)LX-2細(xì)胞 分別將LO2-HBx、LO2-con和未轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞(Mock)的3組細(xì)胞株以 1×105密度接種于6孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時(shí)更換為不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，48 h后吸取培養(yǎng)基，離心后取上清制備成條件培養(yǎng)基。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞在共培養(yǎng)0、24、48 h后的增殖變化 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí)，棄培養(yǎng)基，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜(37 ℃，5%CO2)。細(xì)胞貼壁6 h后，記為0 h，并進(jìn)行CCK-8檢測(cè)；以此時(shí)開始計(jì)算，此后24、48 h再進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。分別在0、24、48 h向培養(yǎng)孔分別加入10 μl CCK-8 溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后用450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 以GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè) HBx、α-SMA、COL1A1、TGFβ1、DBH mRNA的表達(dá)；采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)量 Western Blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中HBx蛋白的表達(dá)量及條件培養(yǎng)基孵育的LX-2中α-SMA和Col1A1蛋白的表達(dá)。采用含50 mmol/L Tris -HCl (pH=7.4),150 mmol/L NaCl,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% 十二烷基硫酸鈉和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L RIPA裂解液分離蛋白質(zhì)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白量，調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl，上樣體積為20 μl。

1.2.7 ELISA檢測(cè)條件培養(yǎng)液及血漿中TGFβ1、HBxAg、DBH和Hyp的含量 在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl。待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液25 μl，然后再加待測(cè)樣品25 μl，按照ELISA試劑盒說明書操作。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：NYSZYYEC20190005。

2 結(jié)果

2.1 3組LO2肝細(xì)胞中 HBx 蛋白的表達(dá) 成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的LO2穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞(LO2-HBx)，可見除LO2-HBx組細(xì)胞外，陰性對(duì)照組和空白組細(xì)胞中不表達(dá)HBx蛋白(圖1)。

圖1 Western Blot檢測(cè)3組LO2肝細(xì)胞系中HBx蛋白的表達(dá)量

2.2 3組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)LX-2細(xì)胞對(duì)其活化的影響

觀察LX-2/LO2-HBx、LX-2/LO2-con、LX-2/Mock 3組共培養(yǎng)體系的LX-2細(xì)胞形態(tài)，在條件培養(yǎng) 48 h后形態(tài)出現(xiàn)明顯分化，其中LX-2/LO2-HBx組LX-2細(xì)胞發(fā)生明顯細(xì)胞形態(tài)變化，出現(xiàn)細(xì)胞收縮，胞突明顯伸長(zhǎng)，胞內(nèi)脂滴減少(圖2a)，其α-SMA和Col1A1 的mRNA(F值分別為144.712和76.680，P值均<0.01)及蛋白(F值分別為234.142和528.708，P值均<0.001)表達(dá)水平均升高(圖2b、c)。

注：a，LX-2細(xì)胞形態(tài)變化；b，α-SMA和Col1A1mRNA表達(dá)變化；c，α-SMA和Col1A1蛋白表達(dá)變化。圖2 3組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞培養(yǎng)48 h后形態(tài)及α-SMA和Col1A1表達(dá)變化

2.3 3組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)LX-2細(xì)胞對(duì)其增殖的影響 LX-2/LO2-HBx組LX-2細(xì)胞在條件培養(yǎng)48 h后增殖活力高于LX-2/LO2-con組LX-2細(xì)胞(P<0.05)(圖3)。

注：與LX-2/LO2-con組比較，*P<0.05。圖3 CCK-8檢測(cè)3組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞的增殖活力

2.4 檢測(cè)條件培養(yǎng)基中TGFβ1的含量及條件培養(yǎng)后LX-2細(xì)胞中TGFβ1與DBH mRNA表達(dá)變化 TGFβ1在LO2-HBx組細(xì)胞條件培養(yǎng)基中含量升高(F=324.701,P<0.01)(圖4a);在培養(yǎng)LX-2細(xì)胞48 h后提取3組細(xì)胞RNA，檢測(cè)細(xì)胞中TGFβ1及DBH mRNA表達(dá)量,LX-2/LO2-HBx組LX-2細(xì)胞中TGFβ1(F=29.382,P<0.01)(圖4b)及DBH(F=42.662,P<0.01)mRNA表達(dá)量均升高(圖4c)。

注：a，3組條件培養(yǎng)液中TGFβ1含量檢測(cè)；b、c，條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后LX-2細(xì)胞中TGFβ1及DBHmRNA表達(dá)變化。圖4 條件培養(yǎng)基中TGFβ1的含量及條件培養(yǎng)后LX-2細(xì)胞中TGFβ1及DBH 表達(dá)變化

2.5 TGFβ1受體抑制劑處理LX-2/L02-HBx組細(xì)胞后DBH的變化 將L02-HBx條件培養(yǎng)基分為2組，分別為10 μmol/L SB-431542 處理組(LX-2/LO2-HBx/SB-431542)和PBS處理組(LX-2/LO2-HBx)，培養(yǎng)LX-2細(xì)胞48h后提取2組細(xì)胞RNA，檢測(cè)2組細(xì)胞中Col1A1及DBH mRNA的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入TGFβ1受體抑制劑的LX-2/LO2-HBx/SB-431542 組LX-2細(xì)胞中Col1A1(t=5.798,P<0.01)及DBH (t=3.603,P<0.05)mRNA表達(dá)量均下降(圖5)。

圖5 加入TGFβ1受體抑制劑處理后LX-2/LO2-HBx組細(xì)胞Col1A1及DBH的mRNA表達(dá)變化

2.6 重組人TGFβ1(rhTGFβ1)刺激LX-2細(xì)胞檢測(cè)DBH表達(dá)變化 將LX-2細(xì)胞分為4組進(jìn)行處理，分別為:(1)無處理組；(2)加入5 ng/ml rhTGFβ1(5 ng/ml組)；(3)加入10 ng/ml rhTGFβ1(10 ng/ml組)；(4)加入15 ng/ml rhTGFβ1(15 ng/ml組)；培養(yǎng)48 h后提取4組細(xì)胞RNA，檢測(cè)細(xì)胞中α-SMA、Col1A1及DBH mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著rhTGFβ1刺激濃度的增加，α-SMA(F=1 794.031，P<0.01)、Col1A1(F=91.340，P<0.01)及DBH(F=2 501.011，P<0.01)表達(dá)增加，在rhTGFβ110 ng/ml時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)rhTGFβ1濃度達(dá)到15 ng/ml時(shí)，α-SMA、Col1A1及DBH的表達(dá)開始由峰值下降(圖6)。

2.7 臨床樣本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量檢測(cè) 慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝細(xì)胞癌患者血漿中的HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量均高于健康對(duì)照組(P值均<0.001)(表1)；血漿中HBx與TGFβ1之間、TGFβ1與DBH之間、Hyp與DBH之間的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.931、0.863、0.765(P值均<0.001)(圖7)。

圖7 臨床樣本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH相關(guān)性分析

表1 ELISA 檢測(cè)4組臨床樣本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量

3 討論

微小的肝癌病灶難被發(fā)現(xiàn)，且肝臟血供豐富，易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，許多患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)的機(jī)會(huì)[6]。因此，在肝細(xì)胞發(fā)生癌變前，找到有效的診斷和治療靶點(diǎn)，阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝炎-肝硬化的進(jìn)程，對(duì)于肝細(xì)胞癌的防治十分重要。

HBx蛋白是HBV基因中最小也是最常整合在宿主基因組中的X基因編碼的蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖凋亡及信號(hào)傳遞等，與病毒復(fù)制及肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞及其微環(huán)境之間的相互作用可維持組織穩(wěn)態(tài)并對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展有著重要影響。本研究通過穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的LO2細(xì)胞系來模擬HBV感染肝細(xì)胞的狀態(tài)，探究HBV感染后細(xì)胞微環(huán)境變化對(duì)HSC的影響。發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的LO2細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液中TGFβ1含量增加，其制備成的條件培養(yǎng)基可促進(jìn)HSC LX-2的活化和增殖，并上調(diào)HSC LX-2細(xì)胞中TGFβ1和DBH的表達(dá)。已有許多研究[7]證實(shí)TGFβ1是強(qiáng)效促纖維化因子，在肝纖維化中具有重要作用，是HSC活化的重要促進(jìn)因子。本研究將rhTGFβ1設(shè)置不同濃度梯度刺激LX-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著rhTGFβ1濃度的增加，LX-2的活化標(biāo)志物α-SMA、Col1A1均表達(dá)上調(diào)。據(jù)此推測(cè)HBx可能通過上調(diào)TGFβ1促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖活化。

肝臟的主要生理功能如消化、免疫、代謝、再生等均與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控密切相關(guān)，交感神經(jīng)系統(tǒng)在各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[8]，例如交感神經(jīng)可維持肝細(xì)胞癌的炎癥微環(huán)境，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生[9]；交感神經(jīng)系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)HSC和肝上皮祖細(xì)胞的表型來調(diào)節(jié)肝臟修復(fù)；自主神經(jīng)系統(tǒng)能調(diào)節(jié)肝臟再生和凋亡[10-11]。DBH可催化多巴胺形成去甲腎上腺素，去甲腎上腺素是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要遞質(zhì)。美國(guó)科學(xué)家Oben等[12]研究報(bào)道指出，肝纖維化中最重要的一類細(xì)胞——HSC ,可以合成和釋放去甲腎上腺素，HSC表達(dá)多種亞型的腎上腺素受體，能接受交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)纖維的支配，他們發(fā)現(xiàn)Dbh基因缺陷小鼠來源的HSC細(xì)胞不能合成去甲腎上腺素，在培養(yǎng)基中增殖緩慢，加入去甲腎上腺素后，增殖能力恢復(fù)，并且Dbh基因缺陷小鼠在肝損傷后的纖維化發(fā)生也受到阻礙。Coll等[13]對(duì)實(shí)施門靜脈結(jié)扎的大鼠模型和肝硬化大鼠模型的腸系膜動(dòng)脈樣本中檢測(cè)到50個(gè)與神經(jīng)傳遞特別是腎上腺素能相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中DBH、Th和Snap25下調(diào)最明顯，這些基因的表達(dá)下調(diào)可能與門靜脈高壓的高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)下內(nèi)臟和周圍血管舒張有關(guān)?，F(xiàn)有的相關(guān)文獻(xiàn)提示DBH可能在肝硬化發(fā)展過程中有重要作用。但目前為止，DBH的研究大部分集中在神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病、精神分裂癥等，其在肝臟疾病中的研究十分罕見。本研究首次發(fā)現(xiàn)TGFβ1可誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞中DBH的表達(dá)，DBH的含量隨著rhTGFβ1濃度的升高而增加，當(dāng)高濃度的rhTGFβ1(15 ng/ml)處理時(shí)，DBH表達(dá)較峰值明顯下調(diào)，LX-2的活化標(biāo)志物α-SMA、Col1A1表達(dá)也從峰值開始下降。在條件培養(yǎng)液中加入TGFβ1受體抑制劑后DBH和Col1A1的表達(dá)下調(diào)。據(jù)此結(jié)果推測(cè)在一定濃度范圍內(nèi)，TGFβ1可誘導(dǎo)DBH的表達(dá)，促進(jìn)HSC 的增殖活化。但TGFβ1具體如何作用使DBH表達(dá)升高，DBH又是如何參與了HSC 的活化，這些問題還需深入的功能和機(jī)制研究來明確。

為了進(jìn)一步探究HBx、TGFβ1、DBH 在慢性乙型肝炎發(fā)展不同階段的表達(dá)情況及相關(guān)性，本研究分別檢測(cè)了健康體檢者、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝細(xì)胞癌患者血漿中HBx、TGFβ1、DBH和Hyp的表達(dá)量。Hyp是一種非必需氨基酸，是膠原蛋白中含量最多的氨基酸，在膠原合成中起著至關(guān)重要的作用[14]。膠原蛋白是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分，通過血漿Hyp的測(cè)定，可了解體內(nèi)膠原蛋白分解代謝情況，因此常被用于評(píng)估HSC 的激活和肝硬化疾病狀態(tài)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)HBx、TGFβ1、DBH、Hyp在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝細(xì)胞癌患者血漿中均明顯升高，且HBx與TGFβ1、TGFβ1與DBH之間相關(guān)性強(qiáng)，從臨床水平驗(yàn)證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得到的HBx可誘導(dǎo)TGFβ1分泌，TGFβ1又可促進(jìn)DBH表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究首次在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝細(xì)胞癌患者血漿中DBH的含量明顯升高，且DBH與血漿中TGFβ1和Hyp的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，提示DBH可能與慢性乙型肝炎-肝硬化發(fā)展過程有關(guān)，為乙型肝炎相關(guān)疾病的研究提供了新線索。在將來的研究中需擴(kuò)大樣本量檢測(cè)，并將DBH含量與其他肝功能及肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合分析，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并深入機(jī)制研究，將更有利于闡明DBH在慢性乙型肝炎-肝硬化-肝癌發(fā)展過程中的作用及機(jī)制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：任婷玉負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料統(tǒng)計(jì)分析，撰寫論文；聶赫中容負(fù)責(zé)論文實(shí)驗(yàn)方法整理；肖利佳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)思路指導(dǎo)，修改論文；林芳楠負(fù)責(zé)論文實(shí)驗(yàn)材料整理；王大明負(fù)責(zé)收集臨床樣本及醫(yī)學(xué)倫理申請(qǐng);宋春麗負(fù)責(zé)臨床樣本指標(biāo)檢測(cè)及論文數(shù)據(jù)核對(duì);周義文負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。