由鵬飛，薛維麗，杭寶健，李春煥，王玉團，陳曉，咸瑞卿

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)屬于低分子肝素類(low molecular weight heparin，LMWH)藥物，具有抗血栓作用強、出血風險小的特點[1-2]，主要用于預防靜脈血栓形成；治療已形成的深靜脈血栓及肺栓塞；預防血液透析體外循環(huán)時血栓的形成；與阿司匹林聯(lián)用治療不穩(wěn)定性心絞痛和非Q波心梗等[3]。依諾肝素鈉注射液最早由法國Aventis公司研制，是目前LMWH藥物中最為暢銷的品種[4-5]。依諾肝素鈉注射液及原料在《英國藥典》(BP2019)、《美國藥典》(USP42)均有收錄，《歐洲藥典》(EP10.0)收錄了依諾肝素鈉原料，此外2017年國家藥典委還公布了依諾肝素鈉注射液及原料的征求意見稿。

分子量與分子量分布與抗凝活性關(guān)系密切[6]，是依諾肝素鈉的重要的質(zhì)控指標[7]，目前各生產(chǎn)企業(yè)標準均采用分子排阻色譜法測定，但所用對照品、色譜柱、流動相、檢測器類型、限度要求均有所不同，不能有效評價樣品的質(zhì)量差異，因此我們以2019年依諾肝素鈉注射液國家評價抽驗為依據(jù)，在法定檢驗的基礎(chǔ)上，采用原研制劑質(zhì)量標準的方法對國內(nèi)各生產(chǎn)企業(yè)的樣品進行了分子量與分子量分布的測定，考察國內(nèi)仿制制劑與原研制劑的差異，并將該結(jié)果與各企業(yè)質(zhì)量標準方法測定結(jié)果進行了比較，為進一步統(tǒng)一質(zhì)量標準，提高仿制藥與原研制劑的一致性，加強產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(2487紫外檢測器，2414示差檢測器，Empower工作站)；Mettler Toledo XSE205DU電子天平；Millipore超純水機。

水為Millipore Q-POD制備的純化水；其他試劑均為分析純。

依諾肝素鈉注射液來自2019年國家評價性抽驗，包括6家國產(chǎn)企業(yè)及1家原研企業(yè)(賽諾菲)的各3批樣品。WHO低分子量肝素分子量測定對照品(批號：05/112)；EP低分子量肝素分子量測定對照品(批號：3.0 Mn3800)；USP低分子肝素鈉分子量測定對照品A(貨號：1235853，分子量為1 400、2 250、4 550、9 250 Da)、USP低分子肝素鈉分子量測定對照品B(貨號：1235864，分子量為1 800、3 350、6 650 Da)。

2 試驗方法

2.1 法定檢驗方法 按各企業(yè)執(zhí)行的質(zhì)量標準檢驗，共7個標準，分別為原國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH04982006、YBH00362015、YBH00692013、YBH00062014、YBH01132015、YBH02232016、JX20140211，其中原研制劑進口注冊標準為JX20140211。各企業(yè)標準中分子量與分子量分布項下方法均有所不同，通過調(diào)研確定了各企業(yè)所用的對照品來源，方法匯總見表1。

表1 各企業(yè)分子量與分子量分布方法

2.2 原研制劑方法

2.2.1 溶液配制 對照品溶液的制備：取WHO低分子量肝素分子量測定對照品適量，加流動相溶解，制成每1 mL約含10 mg的溶液，搖勻。

供試品溶液的制備：取本品適量加流動相制成每1 mL約含1 500 IU的溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱TSK G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；柱溫35 ℃；流動相 0.1 mol·L-1醋酸銨溶液；流速：0.5 mL·min-1；進樣體積25 μL；示差折光檢測器。

2.2.3 測定方法 取對照品溶液25 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。準確計算對照品溶液色譜圖中依諾肝素的總面積(不包括鹽峰)及每個點的累積峰面積百分比，確定與依諾肝素鈉分子量對照品附帶的寬分布標樣表中累積峰面積百分比最接近點的保留時間及對應(yīng)的分子量，以保留時間為橫坐標，分子量的對數(shù)值為縱坐標，使用GPC軟件，擬合三次方程，建立校正曲線，相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.990。

取供試品溶液25 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，數(shù)據(jù)采用GPC軟件處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 重均分子量結(jié)果 將各企業(yè)樣品采用各自質(zhì)量標準方法與原研制劑方法的檢測結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)原研制劑方法測得的重均分子量普遍高于法定檢驗結(jié)果，但大部分企業(yè)差異不大，偏差在2%以內(nèi)，其中企業(yè)D二者結(jié)果差異顯著，偏差為8%。企業(yè)D采用的是EP對照品，其數(shù)據(jù)處理方法較其他采用EP對照品的廠家不同，其他企業(yè)采用紫外檢測器和示差檢測器聯(lián)用，用GPC軟件統(tǒng)計保留時間與分子量的三階曲線方程計算供試品的分子量與分子量分布，而該企業(yè)僅使用示差檢測器，是以低分子量端的第一個峰分子量為600計，每增加一個峰分子量遞增600，由Origin軟件統(tǒng)計對照品分子量與保留時間的二次曲線方程，由GPC軟件計算供試品的分子量與分子量分布，該方法可能帶來較大的誤差；將各企業(yè)樣品均采用原研制劑方法進行檢測，可看出不同企業(yè)樣品的重均分子量有所差別，其中企業(yè)A的重均分子量最低，企業(yè)E和企業(yè)F的重均分子量較高，與原研制劑差異較大，其余廠家與原研制劑相差不大，結(jié)果見圖1。

圖1 重均分子量測定結(jié)果

3.2 分子量分布結(jié)果 采用各企業(yè)標準測得的部分樣品分子量與分子量分布與原研制劑方法測定結(jié)果有一定差異，原研方法與各企業(yè)方法相比，小于2 000的級分均有所降低，而大于8 000的級分略有升高，2 000～8 000的級分變化不明顯；各企業(yè)樣品均采用原研制劑的方法進行檢測，可看出不同企業(yè)的分子量分布也有所不同，重均分子量越高，大于8 000的級分比例越大，小于2 000的級分比例越小，企業(yè)B、C、D與原研制劑較一致，其余3家企業(yè)分子量分布與原研制劑有一定差異，這與重均分子量的檢測結(jié)果相一致，結(jié)果見圖2～4。

圖2 小于2 000的級分測定結(jié)果

圖3 2 000～8 000的級分測定結(jié)果

圖4 大于8 000的級分測定結(jié)果

4 討論

目前依諾肝素鈉注射液的7家生產(chǎn)企業(yè)均采用不同的質(zhì)量標準，對照品來源也各有不同，分別為EP、USP、WHO，目前中檢院也標定了低分子肝素鈉對照品用于分子量與分子量分布檢查，國內(nèi)各企業(yè)均采用的是EP和USP的對照品，其中EP為寬分布對照品，利用紫外和示差檢測器，根據(jù)紫外圖譜和示差圖譜的峰面積及時間差計算每個時間點的分子量，與保留時間擬合三階校準曲線[8]，該方法需要人工選點，選點不同對結(jié)果有一定影響，計算較復雜，小分子量片段結(jié)果不夠精確[9]；USP采用兩套窄分布校正對照品，使用示差檢測器，以各峰的保留時間與Mr擬合三階校準曲線，該方法較為準確，但其對照品制備困難，價格昂貴[7]；而依諾肝素鈉注射液中國藥典征求意見稿(2017年)方法與原研制劑的方法一致，采用的是中檢院對照品和WHO對照品，這兩種對照品均給出了寬分布標樣表，根據(jù)表中給出的相對分子質(zhì)量與累積峰面積百分比擬合三階校準曲線，二者所提供的分子量分布一致，我們進行了2個對照品的比較，發(fā)現(xiàn)二者無顯著性差異，該方法采用示差檢測器，操作簡單，測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定。不同分子量與分子量分布方法及不同來源對照品的測定結(jié)果存在差異，采用各企業(yè)標準的方法無法有效評價不同產(chǎn)品的質(zhì)量。我們同時采用原研制劑的方法測定了中國市場、美國市場、歐洲市場原研制劑的分子量與分子量分布，發(fā)現(xiàn)不同來源的原研制劑分子量與分子量分布差異不大，但國內(nèi)部分企業(yè)與原研制劑相比差異較大。因此我們建議參照中國藥典征求意見稿盡快統(tǒng)一質(zhì)量標準，為提高仿制藥與原研制劑的一致性，更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。