亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        天然冰片對6-OHDA誘導的PC12細胞損傷的保護作用

        2021-07-24 02:24:56孫志軍張俊婷張群林
        現(xiàn)代中藥研究與實踐 2021年3期
        關(guān)鍵詞:實驗模型

        孫志軍,吳 丹,張俊婷,鄭 琴,張群林*

        (1. 安徽醫(yī)科大學 藥學院,安徽 合肥 230032;2. 江西中醫(yī)藥大學 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,江西 南昌 330004)

        冰片包括天然冰片和合成冰片,天然冰片由樟科植物樟Cinnamomum camphora(L.) presl的新鮮枝、葉經(jīng)提取加工制成。冰片在古籍中多以“龍腦香”“龍腦”為正名。宋代《本草衍義》記載:“此物大通,利關(guān)膈熱塞,其清香為百藥之先”。明代《本草綱目》記載:“龍腦香,釋名片香、羯婆羅香。辛、苦,微寒,無毒。療腦痛,通諸竅,散郁火”。研究表明冰片可通過鎮(zhèn)痛[1]、抗炎[2]、抗氧化[3]和抗癲癇[4]等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用,從而改善局灶性腦缺血[5]、阿爾茨海默癥[6]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導致的神經(jīng)功能損傷。PC12細胞是一種可顯示多種神經(jīng)元特性的神經(jīng)細胞株,已被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[7-9]。6-OHDA是一種常見的用于實驗模擬黑質(zhì)變性的神經(jīng)毒素[10]。本實驗將建立6-OHDA誘導的PC12細胞損傷模型,用于研究天然冰片是否對PC12細胞具有保護作用,分別利用MTT法、倒置顯微鏡和流式細胞儀來檢測細胞存活率、觀察細胞形態(tài)以及檢測細胞凋亡情況。

        1 材料與方法

        1.1 試藥與儀器

        天然冰片(批號:20170112)購于吉安市聚鵬天然香料油有限公司;6-OHDA(批號:18834)購于美國MCE生物科技公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購于上海源培生物科技股份有限公司;胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(100 ×)、胰酶購于中國碧云天生物有限公司;噻唑藍(MTT)購于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購于國藥化學試劑有限公司;TH4-200型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);FACSVerse型流式細胞儀(美國碧迪公司);Synergy HTX型酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1天然冰片溶液的配制 精密稱取天然冰片粉末適量,用DMSO溶解配成濃度為200 mg/mL的儲備液,4°C保存,使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

        1.2.2細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清中,青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL的DMEM高糖培養(yǎng)液,37℃,5% CO2。取對數(shù)生長期細胞傳代,用胰酶消化,倒置顯微鏡下觀察,計數(shù)并進行后續(xù)實驗。

        1.2.3天然冰片對正常PC12細胞毒性實驗 將PC12細胞分為對照組和天然冰片濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的實驗組。首先,將PC12細胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。然后,對照組加入100 μL細胞培養(yǎng)液;實驗組加入100 μL不同濃度的天然冰片溶液。每個濃度設置4個復孔,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,用PBS沖洗3次。接著,在每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO溶液。最后,將96孔板置于37℃搖床上震蕩10 min至顆粒充分溶解,在酶標儀上測定490 nm處的吸光度值,計算細胞存活率。

        1.2.4細胞存活率實驗 將PC12細胞分為對照組、模型組和天然冰片濃度分別為7.5、15、30、60、120 μg/mL的實驗組。首先,將PC12細胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。然后,對照組加入100 μL細胞培養(yǎng)液;模型組加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液;實驗組提前24 h加入100 μL不同濃度天然冰片溶液培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)天然冰片溶液,PBS沖洗3次,加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后用MTT法檢測細胞存活率。(MTT實驗方法同“1.2.3”)

        1.2.5細胞形態(tài)學實驗 將PC12細胞分為對照組、模型組和天然冰片濃度分別為7.5、15、30 μg/mL的實驗組。首先,將PC12細胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h;然后,對照組加入2 mL細胞培養(yǎng)液;模型組加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液;實驗組提前24 h加入2 mL不同濃度天然冰片溶液培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)天然冰片溶液,PBS沖洗3次,加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后置倒置顯微鏡下觀察并拍照。

        1.2.6細胞凋亡率實驗 PC12細胞分組及給藥方法同“1.2.5”。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明,胰酶消化并收集各組細胞于15 mL離心管中,在4℃、1 500 r/min條件下離心5 min,棄上清;用PBS沖洗2次后再次離心5 min,棄上清,收集細胞,用400 μL Annexin V結(jié)合液重懸細胞,轉(zhuǎn)至流式管中,在細胞懸液中加入Annexin V-FITC染色液5 μL,輕輕混勻后,置于冰上避光孵育15 min,然后加入10 μL PI染色液,輕輕混勻后于冰上避光孵育5 min后即可用流式細胞儀檢測,檢測波長為488 nm。

        1.2.7統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù) ± 標準差(±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 天然冰片對正常PC12細胞毒性實驗結(jié)果

        實驗結(jié)果顯示,天然冰片濃度在0 ~ 200 μg/mL范圍內(nèi)時,PC12細胞存活率大于85%;當天然冰片濃度低于140 μg/mL時,PC12細胞存活率高于對照組細胞存活率,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明該濃度范圍的天然冰片對正常PC12細胞具有增殖作用;當天然冰片濃度高于160 μg/mL時,PC12細胞存活率低于對照組細胞存活率,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明該濃度范圍的天然冰片對正常PC12細胞有一定的毒性作用,結(jié)果見表1。

        表1 天然冰片對正常PC12細胞存活率的影響(±s, n = 6)Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells(±s, n = 6)

        表1 天然冰片對正常PC12細胞存活率的影響(±s, n = 6)Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells(±s, n = 6)

        注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

        組別 細胞存活率/%對照組 100.0 ± 0.5天然冰片組(20 μg/mL) 158.2 ± 2.6**天然冰片組(40 μg/mL) 156.3 ± 2.1**天然冰片組(60 μg/mL) 152.1 ± 1.4**天然冰片組(80 μg/mL) 149.6 ± 0.6**天然冰片組(100 μg/mL) 146.2 ± 1.1**天然冰片組(120 μg/mL) 117.4 ± 1.0**天然冰片組(140 μg/mL) 112.6 ± 2.3**天然冰片組(160 μg/mL) 97.6 ± 1.5*天然冰片組(180 μg/mL) 94.3 ± 2.1*天然冰片組(200 μg/mL) 86.3 ± 1.5**F 1 447.318 P 0.000

        2.2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞存活率的影響

        實驗結(jié)果顯示,對照組細胞存活率為(100 ±1.2)%,模型組細胞存活率為(71.5 ± 2.3)%,模型組細胞存活率低于對照組細胞存活率,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),該結(jié)果表明6-OHDA對PC12細胞具有損傷作用,提示建模成功;實驗組細胞存活率高于模型組細胞存活率,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),天然冰片濃度為15 μg/mL時,PC12細胞存活率最高,為(96.7 ± 2.6)%,結(jié)果見表2。以上結(jié)果表明,天然冰片可提高6-OHDA誘導損傷的PC12細胞的存活率。

        表2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞存活率的影響 (±s, n = 6)Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA (±s, n = 6)

        表2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞存活率的影響 (±s, n = 6)Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA (±s, n = 6)

        注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比,#P<0.05,##P<0.01

        組別 細胞存活率/%對照組 100.0 ± 1.2模型組 71.5 ± 2.3**天然冰片組(7.5 μg/mL) 83.5 ± 1.9##天然冰片組(15 μg/mL) 96.7 ± 2.6##天然冰片組(30 μg/mL) 87.4 ± 3.9##天然冰片組(60 μg/mL) 80.7 ± 4.5##天然冰片組(120 μg/mL) 77.6 ± 5.1#F 47.167 P 0.000

        2.3 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞形態(tài)學的影響

        倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài),可見對照組PC12細胞呈梭形,胞體飽滿,密度大,折光性較強(圖1A);與對照組相比,模型組PC12細胞體型變小,部分細胞損傷成圓形,密度減小,折光性減弱(圖1B);與模型組相比,實驗組PC12細胞體型變大,密度增大,折光性增強,天然冰片濃度為15 μg/mL時效果最好(圖1C、D、E)。以上結(jié)果表明,天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞有形態(tài)保護作用。

        圖1 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞形態(tài)學的影響Fig.1 Effect of natural borneol on the cell morphology of PC12 cells injured by 6-OHDA

        2.4 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡的影響

        實驗結(jié)果顯示,6-OHDA主要誘導PC12細胞早期凋亡,見圖2。對照組細胞凋亡率為 (0.6 ± 0.02) %,模型組細胞凋亡率為(28.7 ± 0.6)%,模型組細胞凋亡率高于對照組細胞凋亡率,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),該結(jié)果表明6-OHDA對PC12細胞具有損傷作用,提示建模成功。實驗組細胞凋亡率低于模型組細胞凋亡率,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),天然冰片濃度為15 μg/mL時,PC12細胞凋亡率最低,為(7.3 ± 0.4)%,結(jié)果見表3。以上結(jié)果表明,天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡有抑制作用。

        圖2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡的影響 (±s, n = 6)Fig.2 Effect of natural borneol on the apoptosis of PC12 cells injured by 6-OHDA (±s, n = 6)

        表3 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡率的影響(±s, n = 6)Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA (±s, n = 6)

        表3 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡率的影響(±s, n = 6)Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA (±s, n = 6)

        注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

        組別 細胞凋亡率/%對照組 0.6 ± 0.02模型組 28.7 ± 0.6**天然冰片組(7.5 μg/mL) 20.4 ± 0.4##天然冰片組(15 μg/mL) 7.3 ± 0.4##天然冰片組(30 μg/mL) 11.7 ± 0.4##F 2 019.042 P 0.000

        3 討論

        有文獻報道芳香開竅藥對神經(jīng)細胞有很好的保護作用,蘇合香揮發(fā)油可保護大鼠皮層神經(jīng)細胞免受糖氧剝奪/再復氧(OGD/R)的損傷[11];麝香可保護局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元[12]。但這類中藥大部分成分復雜,藥效成分不明確,生物靶點多,這就導致其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的藥效成分很難確定。天然冰片為小分子化合物,2020年版《中國藥典》規(guī)定天然冰片含右旋龍腦不得少于96.0%,其具有藥效成分單一、明確、純度高的優(yōu)點。本研究以6-OHDA誘導損傷的PC12細胞為實驗對象,對天然冰片的神經(jīng)保護作用進行了研究。結(jié)果顯示,天然冰片可以保護PC12細胞免受神經(jīng)毒素6-OHDA的損傷,但天然冰片保護PC12細胞的機制尚不明確。芳香開竅藥石菖蒲的藥效成分β-細辛醚可通過抑制TNF-α、IL-1β的分泌,下調(diào)水通道蛋白4(AQP4)的表達來保護星形膠質(zhì)細胞,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13],天然冰片可能通過相似的機制發(fā)揮對PC12細胞的保護作用,課題組后期將對其機制進行研究。

        有文獻報道天然冰片可通過抑制腦海馬體CA1、CA3區(qū)中瞬時受體電位錨蛋白1(TRPA1)和瞬時感受器電位香草酸受體Ⅰ型蛋白(TRPV1)的表達以及增加神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的釋放,對癲癇持續(xù)狀態(tài)模型小鼠發(fā)揮抗驚厥作用[14];天然冰片可通過增加B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因表達量,降低Bcl-2相關(guān)蛋白的表達來實現(xiàn)對阿爾茲海默癥的治療作用[6]。已有研究表明天然冰片對神經(jīng)損傷有治療作用。本研究不足之處在于未對天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞的治療作用進行研究,后期將進行考察。

        4 結(jié)論

        本研究表明芳香開竅藥天然冰片可以保護6-OHDA誘導損傷的PC12細胞,具有神經(jīng)保護作用。但天然冰片發(fā)揮神經(jīng)保護作用具體的機制有待進一步研究。本研究為芳香開竅藥天然冰片的神經(jīng)保護作用提供了理論依據(jù)和實驗支持,為天然冰片應用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

        猜你喜歡
        實驗模型
        一半模型
        記一次有趣的實驗
        微型實驗里看“燃燒”
        重要模型『一線三等角』
        重尾非線性自回歸模型自加權(quán)M-估計的漸近分布
        做個怪怪長實驗
        3D打印中的模型分割與打包
        NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實驗的改進
        實踐十號上的19項實驗
        太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
        FLUKA幾何模型到CAD幾何模型轉(zhuǎn)換方法初步研究
        久久久男人天堂| 浪货趴办公桌~h揉秘书电影| 人妻少妇精品无码专区动漫| 欧美激情在线不卡视频网站| 一本一道久久a久久精品综合蜜桃| 91亚洲国产成人精品一区.| 色偷偷av一区二区三区| 日韩av无码成人无码免费| 国产成人精品cao在线| 久久久人妻精品一区bav| 夜夜爽妓女8888888视频| 天码av无码一区二区三区四区| av手机天堂| 精品亚洲av乱码一区二区三区| 色欲人妻综合aaaaa网| 奇米影视久久777中文字幕 | 比比资源先锋影音网| 91综合久久婷婷久久| 亚洲一区二区三区视频免费看| 国产精品日本中文在线| 99久久国产精品网站| 永久免费观看国产裸体美女 | 女人天堂av人禽交在线观看| 麻豆影视视频高清在线观看| 日本在线视频网站www色下载| 久久狠狠髙潮曰十八女人| 免费观看全黄做爰大片| 精品久久人人妻人人做精品| 狠狠色丁香婷婷久久综合2021 | 亚洲精品综合色区二区| 亚洲国产免费不卡视频| 欧美人与动人物牲交免费观看久久| 亚洲自偷自拍另类图片小说| 午夜精品人妻中字字幕 | 国精产品推荐视频| 巨爆乳中文字幕爆乳区| 免费av一区男人的天堂| 国产欧美成人一区二区a片| 少妇高潮精品正在线播放| 狠狠亚洲婷婷综合色香五月| 亚洲一区二区三区在线观看蜜桃|