孔 宇， 許雅薈， 張 旭， 韓 冉， 王汝華， 劉常金*

（1.天津科技大學 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457；2.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津300457）

香椿是我國特有的一種木質類的蔬菜，其營養(yǎng)豐富，風味獨特，具有較高的食用價值[1]，此外，香椿芽中還有許多生物活性物質，具有抗菌、抗氧化等保健功能，因此又具有極大的藥用價值[2-4]。香椿在我國的分布廣泛，品種繁多，不同地區(qū)、不同種類的香椿香氣和口感都有所不同。根據(jù)香椿的嫩芽和香椿葉的顏色分為綠香椿和紫香椿兩大類，紫香椿的香味較濃，包括淄博香椿、青州紅香椿、黑油椿、西牟紅香椿、臨朐紅香椿、焦作紅香椿、河北紅香椿、常山本地椿、運城紅香椿、四川達州巴山紅，而綠香椿香味略淡，包括青油椿、十堰香椿、永濟香椿、嵐皋香椿[5]。

香椿中含有許多風味化合物，可以呈現(xiàn)出濃郁的香氣。近年來，人們對香椿風味的研究越來越深入[6]，根據(jù)之前的研究表明，能使香椿芽具有特殊香氣的物質包括含硫類化合物、萜烯類化合物、醛類、酯類、醇類化合物等[7-9]。在分析不同種源香椿的風味時，需要對這些揮發(fā)性成分進行萃取，主要方法有水蒸氣蒸餾法、同步蒸餾法、超臨界CO2流體萃取法等。近年來，隨著科學技術的進步，頂空固相微萃取法（HS-SPME）已經成為分析果蔬香氣成分的一種最重要的方法。相較于傳統(tǒng)方法，HS-SPME提高了萃取效率，降低了化合物的損失，避免了溫度與有機溶劑的干擾。而萃取頭類型、萃取時間、萃取溫度對萃取效率和重現(xiàn)性有很大影響。將揮發(fā)性成分提取出來后，再利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GCMS）對化合物進行定性與定量分析[10-14]。

張杰、劉常金等[15-17]采用頂空固相微萃取法萃取不同種類的香椿香氣成分并結合GC-MS進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)萜烯類和含硫類化合物在香椿特征香氣中占主導地位，而且還發(fā)現(xiàn)2-巰基-3，4-二甲基-2，3-二氫噻吩在香椿香氣化合物中起重要作用[18-21]；李楠[22]采用了GC-O-MS對紅香椿種子、芽苗、嫩芽、老葉的風味物質進行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)香椿種子的色譜圖與其他3種差別較大，種子中的萜烯類化合物最多，而芽苗、嫩葉、老葉中含硫類化合物較多，GC-O結果表明紅香椿嫩葉的特征風味物質與含硫化合物相關性較大；Cheng等[23]利用HSSPME-GC-MS測定了131份中國白酒的揮發(fā)性成分，并建立了人工神經網絡識別模型來區(qū)分白酒的產地來源。

本研究中選取10種不同種源表型為紫色的香椿嫩芽，利用HS-SPME結合GC-O-MS對其進行檢測分析，在化學基礎上分析不同種源香椿風味的差異，為香椿的加工利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于實驗的香椿均來源于天津科技大學生物技術實習基地，香椿的具體來源和品種包括：山東省煙臺市西牟紅香椿，山東省濰坊市臨朐紅香椿，山東省淄博香椿，山東省青州紅香椿，河南省焦作紅香椿，安徽省阜陽市黑油椿，四川省達州市巴山紅，山西省運城紅香椿，浙江省衢州市常山本地椿，河北省河間市紅香椿。

1.2 儀器與設備

Agilent7890氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：購于美國安捷倫公司；HT200H SPME手動進樣器、萃取頭（30/50μm PDMS/DVB、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS、100μm PDMS）：購于美國Supelco公司；40 mL頂空萃取瓶：購于上海安普公司；FA1104A電子天平：購于上海精天電子儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：購于常州普天儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理 用電子天平準確稱量不同種源香椿芽1.0 g置于研缽中，將其充分破碎，直到散發(fā)出濃郁的香氣，然后將樣品轉移至40 mL的頂空瓶中，加入10 mL蒸餾水，用封口膜密封，在50℃的恒溫水浴中靜置一段時間使其達到平衡后，再將老化后的萃取頭插入到頂空瓶中進行萃取，萃取完成后，利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對萃取物進行解吸。每個樣品需要做3次平行實驗，最后取其平均值。

1.3.2 GC-MS參數(shù)條件 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；載氣為高純氦氣；進樣溫度為250℃；載氣流量為1.0 mL/min；分流比為20∶1。升溫程序：初始溫度50℃保持5 min，以5℃/min升溫到170℃，保持1 min，再以10℃/min升溫到250℃，保持5 min，溶劑延遲1.5 min。

質譜條件：電離方式選用電子轟擊源（EI），接口溫度為230℃，離子源溫度為210℃，電子能量70 eV，掃描范圍35~500。

1.3.3 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化 影響頂空固相微萃取技術的因素包括萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間[24]。本實驗采用單因素實驗對其進行優(yōu)化。根據(jù)極性和涂層厚度的不同，選用30/50μm PDMS/DVB、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 4種類型的萃取頭對香椿特征香氣物質進行萃?。贿x用的萃取時間分為10、20、30、40、50、60 min 6個梯度；萃取溫度為10、20、30、40、50、60℃6個梯度。根據(jù)不同梯度下的色譜峰的總面積來確定最佳的萃取頭類型、萃取溫度和萃取時間。

1.3.4 GC-O實驗 氣相色譜條件與1.3.2所述一致，采用FID檢測器，色譜柱與嗅聞口的分流比為1∶1。嗅聞實驗由6人（3男3女）組成的聞香小組完成，而且聞香員必須提前進行氣味分辨的培訓。6人各進行3次嗅聞，記錄員需要記錄每個嗅聞員對聞到氣味的語言描述、氣味強度與色譜峰保留的時間。氣味強度分為5個標準，用“+”表示香氣強度最弱，“+++++”表示香氣強度最強。

1.3.5 定性與定量分析 利用計算機檢索與質譜檢索庫NIST11進行化合物的定性分析，再對照已發(fā)表的人工質譜圖，確定其中的香氣成分。采用峰面積歸一化法進行化合物的定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

本實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS21軟件和Origin軟件進行主成分分析，對不同種源紫香椿的風味化合物進行分析。

2 結果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

由于萃取頭涂層纖維的厚度對萃取效率影響重大，因此需要選取合適的萃取頭來確保實驗的準確性[25]。本實驗選用30/50μm PDMS/DVB、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS、100μm PDMS 4種類型的萃取頭進行萃取，結果表明（見表1），相比于其他3種萃取頭，65μm PDMS/DVB的萃取頭所萃取的揮發(fā)性成分的色譜峰面積最大，由此可見，該萃取頭對香椿揮發(fā)性成分的萃取效率最高。

表1 不同萃取頭對揮發(fā)性物質成分萃取效果的影響Table 1 Effect of extraction fibers on extraction efficiency of volatile compounds

一般來說，最佳的萃取時間應該接近吸附平衡的時間。結果表明（見圖1），在40 min之前，萃取時間與色譜峰面積成正比關系，當萃取時間達到40 min時，色譜峰面積也達到最大，若繼續(xù)延長萃取時間，色譜峰面積則會逐漸下降，可能是因為萃取時間過長發(fā)生競爭吸附而導致小分子物質脫附[16]。此結果表明萃取40 min時萃取纖維上吸附的揮發(fā)性成分與樣品頂空瓶內氣體的成分基本達到了相對平衡的狀態(tài)。因此，最佳的萃取時間為40 min。

圖1 萃取時間對色譜峰面積的影響Fig.1 Effect of extraction time on chromatographic peak area

萃取溫度不僅會對揮發(fā)性化合物的性質產生影響，還會影響化合物的吸附時間和速度[26]。由圖2可知，萃取溫度達50℃時，色譜峰面積最大。在10~50℃范圍內，色譜峰面積隨著溫度的升高而增大，繼續(xù)升溫后，色譜峰面積反而減小，這可能是因為溫度過高導致已經吸附的物質發(fā)生解析[16]。因此，最佳的萃取溫度為50℃。

圖2 萃取溫度對色譜峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on chromatographic peak area

2.2 香椿揮發(fā)性物質的鑒定

經過HS-SPME萃取10種不同種源紫香椿揮發(fā)性成分，再用GC-MS分析后，由表2可知，在10種紫香椿中共鑒別出了54種揮發(fā)性化合物，其中包括30種萜烯類化合物、14種含硫類化合物、6種醇類物質、3種醛類物質和1種酸類物質，不同的種源香椿其揮發(fā)性成分略有不同，其中西牟紅香椿檢出36種、臨朐紅香椿32種、淄博香椿27種、青州紅香椿38種、焦作紅香椿39種、黑油椿34種、巴山紅27種、運城紅香椿34種、常山本地椿34種、河北紅香椿36種。這與之前李楠等[22]的研究結果有一些差異，可能是由于萃取方法和條件的優(yōu)化[27-29]，香椿種類的不同，以及質譜檢索庫NIST11的更新，使得本研究中鑒定出了一些新的化合物，如烯丙硫醇、α-葎草烯、金合歡醇、芳樟醇等。這10種不同種源的紫香椿中，2-巰基-3，4-二甲基-2，3-二氫噻吩相對含量最高，分別在20.13%~20.79%之間，其次為β-石竹烯，其相對含量在15.03%~20.01%。焦作紅香椿含有的揮發(fā)性化合物種類最多（39種），淄博香椿和巴山紅含有的揮發(fā)性化合物種類最少（27種）。另外，山東地區(qū)的4種香椿（西牟紅香椿、臨朐紅香椿、淄博香椿、青州紅香椿）所特有的揮發(fā)性成分為（+）-β-芹子烯，河北紅香椿特有的揮發(fā)性成分為2-乙基-5-甲基噻吩、（+）-α-長葉蒎烯、δ-愈創(chuàng)木烯、（+）-長葉環(huán)烯。

表2 10種紫色表型香椿揮發(fā)性香氣物質Table 2 Volatile aroma substances of ten purple phenotype Toona sinensis

續(xù)表2

續(xù)表2

由圖3所可知，在所列的10種紫香椿中，萜烯類化合物相對含量均較高，其次為含硫類化合物，醇類、醛類、酸類的相對含量相對較少，其總相對含量均在9%~11%之間。因此，萜烯類和含硫類化合物是香椿中主要的揮發(fā)性成分。山東地區(qū)的西牟紅香椿、臨朐紅香椿、淄博香椿、青州紅香椿中萜烯類和含硫類化合物的相對含量均高于其他地區(qū)的香椿，尤其是淄博香椿中，這兩類物質都是最高，而巴山紅和常山本地椿的萜烯類和含硫類化合物的相對含量最少。

圖3 10種紫色表型香椿中揮發(fā)性化合物相對含量Fig.3 Relative contents of volatile compounds in ten purple phenotype Toona sinensis

2.3 不同種源香椿特征香氣的鑒定分析

由表3可知，香椿樣品經過GC-O分析，10種紫色表型的香椿分辨出14個揮發(fā)性成分。萜烯類和含硫類化合物是香椿中主要的揮發(fā)性成分，其中有6種含硫類化合物、6種萜烯類化合物、2種醛類化合物，與孫曉健等[30-31]之前報道的研究結果大致相同。2-巰基-3，4二甲基-2，3-二氫噻吩香氣強度最強，β-石竹烯次之，然后是香氣強度為3級的2，5-二甲基噻吩、2，4-二甲基噻吩、硫化丙烯，這說明這5種物質在紫香椿的風味中發(fā)揮重要作用。含硫化合物在嗅聞過程中表現(xiàn)出洋蔥、大蒜等刺激性氣味，其中2-巰基-3，4二甲基-2，3-二氫噻吩表現(xiàn)為香椿特有的氣味。劉常金等[17]研究發(fā)現(xiàn)2-巰基-3，4二甲基-2，3-二氫噻吩并不是香椿本身所含有的物質，而是由二丙烯基二硫醚加熱失去一個H2S形成的。萜烯類化合物在嗅聞過程中表現(xiàn)為酯香、花香、水果香、甜香等的氣味，相對于刺激性的含硫化合物比較柔和，起到了調和含硫化合物刺激性的作用，從而擁有了香椿特有的香氣[32-33]。山東地區(qū)的西牟紅香椿、臨朐紅香椿、淄博香椿、青州紅香椿中萜烯類和含硫類化合物的相對含量明顯高于其他地區(qū)，特征香氣成分豐富，這4種香椿所特有的揮發(fā)性成分為（+）-β-芹子烯，具有略微的葉、草味，在其他地區(qū)的香椿中并未找到。

表3 紫色表型香椿共有特征香氣物質Table 3 Common characteristic aroma substances of purple phenotype Toona sinensis

2.4 主成分分析

主成分分析（PCA）也叫主分量分析，主要是利用降維的原理，將原來復雜的多個變量轉化為少數(shù)的綜合變量（即主成分），每個主成分都代表原始變量的大部分信息，且所含信息不會重復，這種多元統(tǒng)計方法能夠簡單且有效地得到結果[34]。通過主成分分析，進一步簡化了10個種源紫香椿中特征香氣成分的差異分析，如表4所示，特征值大于1的主成分有5個，PC1可以解釋特征香氣差異的31.508%，PC2可以解釋21.758%，PC3可以解釋15.903%，PC4可以解釋11.305%，PC5可以解釋8.216，5個主成分的累計貢獻率為88.690%。

變量的載荷系數(shù)反映了香椿中揮發(fā)性風味成分與各主成分的相關度，載荷系數(shù)絕對值越大，表明該變量對主成分的貢獻也越大[35]。根據(jù)成分載荷系數(shù)表選取前3個主成分進行分析（見圖4），可以解釋特征香氣的69.169%。在表4和圖4中，可以發(fā)現(xiàn)PC1中的石竹烯、2-己烯醛、2，4-二甲基噻吩、（-）-α-蒎烯、硫化丙烯、2，5-二甲基噻吩、3，5-二乙基-1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷載荷系數(shù)較高，對PC1體現(xiàn)的風味影響較大；2-巰基-3，4二甲基-2，3-二氫噻吩、（+）-β-芹子烯、馬兜鈴-9-烯、（-）-α-蓽澄茄油烯決定PC2所體現(xiàn)的風味；3，4-二甲基噻吩、壬醛、β-石竹烯在PC3的風味信息中起重要作用。

圖4 紫色表型香椿PCA分析Fig.4 Principal component analysis of purple phenotype Toona sinensis

表4 主成分的載荷矩陣、特征值、貢獻率、累計貢獻率Table 4 Load matrix,eigenvalue,contribution rate and cumulative contribution rate of principal components

續(xù)表4

2.5 不同種源紫香椿的綜合評價

根據(jù)主成分分析結果，在PCA得分圖（見圖5）中可以區(qū)分出不同種源香椿的香氣成分含量，在PC1方向上，10種香椿可以分為3類，巴山紅為一類，西牟紅香椿、焦作紅香椿、黑油椿為一類，其余的歸為一類，在PC2方向上，10種香椿也表現(xiàn)出顯著性差異。

圖5 紫色表型香椿PCA得分圖Fig.5 PCA score chart of purple phenotype Toona sinensis

以5個 主 成 分F1、F2、F3、F4、F5及 其 特 征 向 量（見表5）構建紫香椿風味評價模型[34]，可以得出綜合評價函數(shù)為F=0.355 3F1+0.245 3F2+0.179 3F3+0.127 5F4+0.092 6F5，按照此公式可以計算出10種紫香椿的綜合得分（F），如表6所示，得分越高表明香椿風味越好。結果表明，紫香椿的香氣成分在品種上有一定的差異，西牟紅香椿風味物質含量的綜合得分為1.749，風味最佳，其次是黑油椿、焦作紅香椿，常山本地椿風味物質含量的綜合得分為-1.078，風味最差。通過對西牟紅香椿不同F(xiàn)值的分析比較，發(fā)現(xiàn)F2最大，因此（+）-β-芹子烯、2-巰基-3，4二甲基-2，3-二氫噻吩、馬兜鈴-9-烯、（-）-α-蓽澄茄油烯對其影響較大，尤其是山東地區(qū)特有的（+）-β-芹子烯，與PC2的相關度最高（見表5）。西牟紅香椿香氣成分豐富，為其加工利用提供一定的理論依據(jù)。

表5 主成分特征向量Table 5 Feature vector of principal components Toona sinensis

表6 10種不同種源紫香椿綜合評價得分Table 6 Comprehensive evaluation score of purple phenotype Toona sinensis from ten different provenances

3 結語

本研究中采用頂空固相微萃取對不同種源表型為紫色的香椿嫩芽揮發(fā)性成分進行提取，并進行條件優(yōu)化，結合GC-O-MS對其揮發(fā)性成分進行檢測及差異性分析。結果表明，HS-SPME技術的最佳萃取條件為65μm PDMS/DVB的萃取頭，在50℃時萃取40 min。采用GC-MS進行定性和定量分析，在10種紫香椿中共鑒別出了54種揮發(fā)性化合物，其中包括30種萜烯類化合物、14種含硫類化合物、6種醇類物質、3種醛類物質和1種酸類物質，其中西牟紅香椿檢出36種、臨朐紅香椿32種、淄博香椿27種、青州紅香椿38種、焦作紅香椿39種、黑油椿34種、巴山紅27種、運城紅香椿34種、常山本地椿34種、河北紅香椿36種。樣品經過嗅聞儀分析，10種紫色表型的香椿分辨出14個揮發(fā)性成分，其中2-巰基-3，4二甲基-2，3-二氫噻吩香氣強度最大，β-石竹烯次之，然后是香氣強度為3級的2，5-二甲基噻吩、2，4-二甲基噻吩、硫化丙烯，這說明這5種物質在紫香椿的風味中發(fā)揮重要作用。山東地區(qū)的4種香椿（西牟紅香椿、臨朐紅香椿、淄博香椿、青州紅香椿）中萜烯類和含硫類化合物的相對含量較其他地區(qū)的高，而且含有特有的揮發(fā)性成分（+）-β-芹子烯。主成分分析結果表明，不同種源紫香椿的香氣成分差異顯著，其中西牟紅香椿的風味最好，山東地區(qū)特有的（+）-β-芹子烯對西牟紅香椿的風味影響最大。因此，該研究結果對紫色表型香椿的風味分析具有參考價值。