李麗敏，周如潔，曹帥，毛秀紅，胡青，季申

(1.上海市食品藥品檢驗研究院,上海 201203;2.國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室,上海 201203)

電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的一種元素檢測方法,其以獨特的接口連接電感耦合等離子體(ICP)源與質(zhì)譜(MS)儀,具有動態(tài)線性范圍寬、干擾少等優(yōu)勢,可同時進行多元素測定和同位素分析,靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均優(yōu)于原子吸收光譜法(AAS)等傳統(tǒng)元素分析法[1],在地質(zhì)、環(huán)境、食品及生命科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛[2-4]。

為滿足藥品中雜質(zhì)元素的分析需求[5-6],國內(nèi)外藥典均收錄了ICP-MS,包括其通則方法、檢測方法、技術(shù)要求或指導(dǎo)原則。藥典收錄的ICP-MS主要關(guān)注有害雜質(zhì)元素的分析,但ICP-MS在中藥中的應(yīng)用還包括有效性物質(zhì)和產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量影響因素的探究,如微量元素、稀土元素的分析及元素形態(tài)及價態(tài)的研究等,因此本工作介紹了ICP-MS在中國、美國及歐洲藥典中的方法體系及應(yīng)用,并對中藥中無機元素分析領(lǐng)域的研究熱點和進展進行總結(jié),對其應(yīng)用前景進行展望,旨在為中藥安全標(biāo)準(zhǔn)制定、中藥安全性和有效性評價等提供參考。

1 國內(nèi)外藥典中關(guān)于ICP-MS的介紹

《中華人民共和國藥典》(2020版)(ChP 2020)四部通則0412,《美國藥典》(USP 43)＜730＞和《歐洲藥典》(EP 10.0)2.2.58中均收載了ICP-MS通則方法[7-9]。通則方法對儀器及測定的基本要求均做了詳細的闡述,但內(nèi)容側(cè)重點和具體要求有一定差異。USP 43和EP 10.0均明確列出了ICP-MS的方法學(xué)驗證或確認的技術(shù)要求,而Ch P 2020 則從儀器基本配置、儀器分析流程、干擾消除、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量方法與方式等方面分別介紹了ICP-MS(測定元素總量)和高效液相色譜-ICP-MS(HPLC-ICPMS,測定元素形態(tài))等兩種方法,3種藥典的簡要介紹見見表1。其中Ⅰ*代指藥物或制劑常量成分含量的測定;Ⅱ*代指痕量雜質(zhì)的含量或限量的測定。

表1 不同藥典中ICP-MS通則方法主要內(nèi)容的比較Tab.1 Comparison of main contents of ICP-MS general method reles in different pharmacopoeias

1.1 ChP 2020

ChP 2020以0412通則方法為基礎(chǔ)形成了相應(yīng)的方法體系(圖1),主要為中藥中重金屬及有害元素的總量及其形態(tài)的研究提供方法指導(dǎo):①“四部”通則2321鉛、砷、鎘、汞、銅測定法將ICP-MS作為推薦方法之一,規(guī)定了ICP-MS測定中藥中重金屬及有害元素的分析參數(shù)和步驟,為“一部”中黃芪等41種中藥以及“四部”注射劑通則的中藥注射劑中的重金屬及有害元素的分析提供方法依據(jù);②“四部”通則9304為ICP-MS測定中藥中鐵、鉻、鋁、鋇等元素的指導(dǎo)原則,能為中藥的非法摻雜和非法增重情況的監(jiān)測提供技術(shù)依據(jù),將該方法與“四部”通則2321合并,能同時測定中藥中的9種元素,提高中藥安全性監(jiān)測篩查范圍和效率;③“四部”通則2322為HPLC-ICP-MS分析汞和砷元素形態(tài)及價態(tài)的方法,該方法列出了二價汞、甲基汞、乙基汞等3種汞元素形態(tài),以及砷膽堿、砷甜菜堿、三價砷、一甲基砷、二甲基砷和五價砷等6種砷元素形態(tài)的儀器分析參數(shù)及分析程序,并針對動植物藥和礦物類中藥等分別列出了供試品前處理的參考方法;2322通則方法用在ChP 2020“一部”礦物藥朱砂和雄黃二價汞和無機砷檢查項中,用于含有毒元素礦物安全性評價指令的安全監(jiān)控。

圖1 ChP 2020中ICP-MS方法體系及其應(yīng)用Fig.1 Method system and application of ICP-MS in ChP 2020

此外,ChP對于ICP-MS在藥用輔料和生物制品中雜質(zhì)元素測定方面也有應(yīng)用,2020年版“四部”輔料明膠空心膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鉻(Cr)檢查項中新增了ICP-MS測定法,通則生物制品相關(guān)檢查方法3208新增了ICP-MS測定人血白蛋白鋁殘留量的方法。

1.2 USP 43

USP 43中＜730＞等離子體光譜法的通則方法收載了ICP-MS和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES),方法體系介紹見圖2。USP 43中ICP-MS主要應(yīng)用在藥品元素雜質(zhì)限量控制、植物藥和膳食補充劑重金屬及有害元素污染控制等方面。

圖2 USP 43中ICP-MS的方法體系及其應(yīng)用Fig.2 Method system and application of ICP-MS in USP 43

USP 43中＜232＞元素雜質(zhì)限量參照了人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則,按照元素毒性和藥品劑型,以每日允許最大暴露量(PDE)為依據(jù),列出了不同劑型原料藥及制劑中24種元素雜質(zhì)的參考限量,主要適用于化學(xué)原料藥、輔料及制劑等類型藥品的元素雜質(zhì)控制,但對植物藥、放射性藥等不適用。USP 43 中＜233＞元素雜質(zhì)測定中列出ICP-AES和ICP-MS兩種方法,其中“分析方法2”ICP-MS以＜730＞通則方法為基礎(chǔ),列出雜質(zhì)元素分析條件、供試品及對照品溶液的制備方法和測定程序及要求等詳細內(nèi)容,同時對其方法學(xué)驗證內(nèi)容和技術(shù)要求均做了詳細的規(guī)定。USP 43中＜2232＞膳食補充劑的元素污染物檢查項以ICP-MS通則方法為基礎(chǔ),列出了ICP-MS分析無機砷和HPLC-ICP-MS分析甲基汞的具體方法,可為元素雜質(zhì)的形態(tài)分析和限量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考。

USP在對植物藥及膳食補充劑的污染物限量進行規(guī)定時考慮了砷、汞元素形態(tài)及價態(tài)限量,其中USP 43中＜561＞規(guī)定了植物藥中砷(無機砷)、鎘、鉛、總汞及甲基汞的限量,＜2232＞規(guī)定了膳食補充劑中無機砷、總汞、鉛、鎘和甲基汞的限量,這些元素的檢測和方法驗證均要遵循＜233＞的技術(shù)要求,元素形態(tài)及價態(tài)可參照＜2232＞列出的無機砷和甲基汞方法。

1.3 EP 10.0

EP 10.0中2.2.58的ICP-MS通則方法(圖3),可為藥品元素雜質(zhì)限量的控制和植物藥重金屬限量控制方法的建立提供依據(jù)。EP 10.0中5.20雜質(zhì)元素限量直接引用ICH Q3D 元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則,2.4.20元素雜質(zhì)測定不僅為5.20提供系統(tǒng)的方法策略和要求,還詳細介紹了雜質(zhì)元素分析的樣品制備、方法選擇和方法學(xué)驗證內(nèi)容和要求,雜質(zhì)元素的測定方法包括ICP-MS、ICP-AES、AAS、AES和X 射線熒光光譜法(XRFS)等,其中ICP-MS 以2.2.58通則方法為基礎(chǔ)。

圖3 EP 10.0中ICP-MS方法體系及其應(yīng)用Fig.3 Method system and applicationof ICP-MS in EP 10.0

由于EP 10.0中雜質(zhì)元素限量標(biāo)準(zhǔn)不適用于植物藥,EP 10.0在專門的草藥章節(jié)中規(guī)定了草藥中鎘、鉛、汞等重金屬元素的限量,并在2.4.27中給出了草藥和草藥制劑中重金屬元素的檢測方法,其中前處理方法推薦使用微波消解法,測定方法列出了AAS、ICP-AES和ICP-MS(也以2.2.58通則方法為基礎(chǔ))等3種方法,其中ICP-MS列出了砷、鎘、銅、汞、鎳、鉛測定時的推薦同位素和系統(tǒng)適用性要求,同時還詳細給出了方法學(xué)驗證要求,包括專屬性、檢測范圍、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度、定量限和檢出限等,比2.2.58的驗證內(nèi)容更詳細。

目前,國內(nèi)外藥典對于藥品中(包括中藥或植物藥)雜質(zhì)元素或污染物限量的要求已由控制雜質(zhì)元素總量轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)注單個元素危害,故對檢測方法的專屬性和靈敏度要求更高。以ICP-MS通則方法為基礎(chǔ)建立的方法體系,如微波消解結(jié)合ICP-MS,已成為中藥重金屬及有害元素研究的主要分析手段[10-11],且隨著ICP-MS的應(yīng)用,其檢測對象已逐漸擴展到更多的無機元素[12-14]和基質(zhì)種類[15-17],已成為中藥元素雜質(zhì)安全性和無機元素有效性研究的重要工具,可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的研究與建立提供方法依據(jù)。

2 ICP-MS在中藥無機成分研究中的應(yīng)用進展

中藥包括植物藥、動物藥和礦物藥,其中含有豐富的無機元素,由于受環(huán)境影響較大,呈現(xiàn)分布復(fù)雜及安全風(fēng)險高等特點。ICP-MS 具有高通量、高靈敏及聯(lián)用接口普適性等優(yōu)勢,可用于研究中藥無機成分及其與安全性和有效性的密切關(guān)系。

2.1 中藥安全性評價及風(fēng)險評估

以ICP-MS研究中藥重金屬及有害元素含量,并同已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進行比較,有助于發(fā)現(xiàn)污染風(fēng)險高的品種[16-19],能為中藥風(fēng)險監(jiān)測和監(jiān)管提供參考。以ICP-MS結(jié)合統(tǒng)計學(xué)軟件研究重金屬及有害元素與中藥產(chǎn)地、炮制工藝及生長時間的相關(guān)性,可為中藥質(zhì)量評價提供依據(jù)。左甜甜等[20]以ICP-MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對不同產(chǎn)地枸杞中鉛、砷、鎘、汞、銅進行了多元統(tǒng)計分析,用于枸杞子藥材的道地性和安全性的評價。柳臻等[21]根據(jù)ICP-MS 研究的何首烏、白芍、當(dāng)歸、川烏等生品和炮制品中鉻、銅、鉛、鋅元素的變化規(guī)律,探究了炮制過程中可能影響重金屬及有害元素變化的主要因素。朱曉東等[22]以ICP-MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對青翹與老翹中鉛、砷、汞、鎘、銅、鉻等元素進行了統(tǒng)計分析,研究了連翹中的元素隨著生長時間延長的變化規(guī)律,可為連翹質(zhì)量分級提供依據(jù)。

利用ICP-MS獲得的大數(shù)據(jù),還可進行安全性風(fēng)險評估(如暴露、致癌/非致癌風(fēng)險評估),能為中藥對人體健康的風(fēng)險評價和其中重金屬及有害元素限量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)[23]。LUO 等[24]采用ICP-MS測定了全球86 種共1 773 批中藥材中的鉛、砷、鎘、汞、銅含量,經(jīng)暴露評估和非致癌風(fēng)險評估后發(fā)現(xiàn)其中25種中藥材中重金屬元素含量超出了可接受范圍,由于砷的危險指數(shù)和致癌風(fēng)險均最高,提出應(yīng)結(jié)合不同砷價態(tài)進行深入研究。YANG等[25]采用ICP-MS測定249種共計10 245批次中藥材中鉛、砷、鎘、汞含量,并采用聚類分析對超標(biāo)藥材的風(fēng)險程度進行分類,結(jié)果顯示:狗脊、卷柏、白及等5種中藥材具有較高的鉛污染風(fēng)險;昆布等3種中藥材具有砷污染風(fēng)險;通草等6種中藥材具有鎘污染風(fēng)險;干漆有汞污染風(fēng)險;崗梅等6種中藥材具有非致癌風(fēng)險。

針對中藥服用特點,采用ICP-MS對中藥中重金屬及有害元素的轉(zhuǎn)移率和生物可及性轉(zhuǎn)移率進行研究,可進一步為中藥健康風(fēng)險評價提供依據(jù)[26-29]。另外,有研究者基于ICP-MS結(jié)果進行了大數(shù)據(jù)分析和風(fēng)險評估,篩選出了具有高風(fēng)險、高蓄積特性的中藥材,開展了其中重金屬及有害元素的含量與土壤關(guān)聯(lián)性研究,以此揭示這些元素的富集特性及蓄積機制[30-31],可為中藥種植環(huán)境、種質(zhì)選擇、優(yōu)化生產(chǎn)等奠定基礎(chǔ)。

2.2 無機元素譜及質(zhì)量評價

微量元素與動植物生長密切相關(guān),對動植物藥效的發(fā)揮起重要作用。動植物從自然界汲取養(yǎng)分,其藥材中的微量元素種類及含量和環(huán)境等因素密切相關(guān)。ICP-MS可用于監(jiān)測多元素含量特征,以此形成的無機元素譜能全面直觀體現(xiàn)中藥中無機元素種類和含量變化,因此,可采用ICP-MS監(jiān)測和評價中藥的質(zhì)量。程益清等[32]以ICP-MS 研究了中藥注射用血塞通從原料到制劑的整個生產(chǎn)環(huán)節(jié)中35種元素的遷移規(guī)律,可為制劑工藝和產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供參考。盧森華等[33]采用ICP-MS 測定了強力枇杷露中20種無機元素,運用主成分分析明確了特征元素,并用建立的模型對中藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量進行了評價。劉圣金等[34]對治糜康栓中18種無機元素特征進行了研究,篩選出12種可對正品和偽品進行甄別的差異元素,用于對中藥制劑摻偽的監(jiān)控。

中藥材生長受地域、環(huán)境、氣候的影響較大,其中的無機元素與產(chǎn)地密切相關(guān)且具有種屬差異。通過統(tǒng)計學(xué)對ICP-MS獲得的無機元素譜的多變量大樣本進行數(shù)據(jù)分析,能較好地揭示特征元素與藥材產(chǎn)地的內(nèi)在聯(lián)系,在道地藥材識別方面具有良好的應(yīng)用前景。ZHAO 等[35]以ICP-MS測定不同產(chǎn)地栽培的遠志藥材中的15種微量元素,通過雷達圖、元素指紋譜和層次聚類分析、主成分分析、判別分析等多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計實現(xiàn)了4個不同產(chǎn)區(qū)藥材的有效識別。MA 等[36]采用類似方法鑒別了不同產(chǎn)地的3個麻黃種屬。DU 等[37]基于元素分析穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜法和ICP-MS結(jié)果,采用層次聚類分析法,較好地區(qū)分3個產(chǎn)區(qū)的黃連,并利用逐步線性判別分析法(SLDA),建立了用于區(qū)分3 個產(chǎn)區(qū)物種的分類模型,利用正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)實現(xiàn)了藥材真?zhèn)蔚蔫b別。

2.3 有害元素形態(tài)及價態(tài)

元素的生理活性和生物毒性與其形態(tài)及價態(tài)密切相關(guān),同一元素的不同形態(tài)及價態(tài)對人體健康具有不同的影響,如三價砷比五價砷更容易與蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合,其毒性較大,甲胂酸和二甲胂酸具有中等毒性,動植物中的砷甜菜堿和砷膽堿幾乎無毒性[38-39];甲基汞、四乙基鉛等有機態(tài)比其對應(yīng)的無機態(tài)毒性強[40-41]。因此,如果僅用元素總量進行中藥風(fēng)險評估,往往會高估其對人體的危害,從而導(dǎo)致藥物被不合理地限制應(yīng)用。HPLC-ICP-MS已作為成熟技術(shù)用于汞、砷元素形態(tài)及價態(tài)分析,已被Ch P和USP收錄,不僅可為中藥科學(xué)合理的評價提供依據(jù),還可為元素毒性遷移及轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供手段。

李耀磊等[42]在研究冬蟲夏草中的有害元素與其產(chǎn)區(qū)土壤的污染水平時發(fā)現(xiàn),冬蟲夏草具有富集砷的特性。XIAO 等[43]在以ICP-MS 和HPLCICP-MS對野生冬蟲夏草中的砷總量、形態(tài)和分布研究時發(fā)現(xiàn),毒性較大的無機砷僅占總砷含量的4%～11%;駱驕陽等[44]采用HPLC-ICP-MS 測定了31種動物藥中砷、汞元素形態(tài)殘留,確定了動物藥中殘留的具有中高風(fēng)險的砷、汞的元素形態(tài)及含量,可為動物藥的安全風(fēng)險評估及限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。LI等[45]建立了HPLC-ICP-MS測定礦物藥青礞石和動物藥地龍中6價鉻含量的方法,可為中藥中鉻元素形態(tài)的研究提供參考。

礦物藥在我國已應(yīng)用千年,其中含有大量的各種形態(tài)的重金屬元素,如以朱砂、雄黃為代表的礦物藥含有大量的汞或砷元素,朱砂的主要成分為硫化汞(HgS),雄黃的主要成分為四硫化四砷(As4S4)。由于國際法規(guī)對重金屬及有害元素總量的限制,使其應(yīng)用倍受質(zhì)疑。本課題組以仿生法提取雄黃、朱砂及其制劑中的可溶性砷、汞,采用HPLC-ICP-MS分析了砷、汞元素形態(tài)[46],可為含砷、汞礦物藥及其制劑質(zhì)量的合理評價提供科學(xué)的方法[47-48]。HPLC-ICP-MS還可用于對含砷、汞礦物藥的體內(nèi)元素形態(tài)吸收、代謝、分布等研究,從而揭示傳統(tǒng)中藥增效解毒的機理及指導(dǎo)人們合理用藥。YI等[49]以HPLC-ICP-MS研究雄黃給藥后大鼠體內(nèi)砷的吸收、分布及砷形態(tài)的變化,發(fā)現(xiàn)雄黃中的可溶性砷被大鼠吸收后,其體內(nèi)含有豐富的二甲基砷,肝、腎含有一甲基砷,肝、腎、腦也有無機砷的分布,血清中砷消除速率較慢,為臨床用藥提供了參考。張慶麗等[50]和王啟錚等[51]分別研究了給藥后的比格犬和大鼠體內(nèi)六神丸和雄黃中砷元素形態(tài)的組織分布變化,并進行了藥動學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)六神丸中的配伍對雄黃中砷具有減毒作用;姜新等[52]采用HPLC-ICPMS對大鼠口服納米雄黃后的砷元素形態(tài)分布進行了研究,發(fā)現(xiàn)納米雄黃可提高砷的生物利用度,但其毒性相較傳統(tǒng)水飛雄黃也同時增加。

3 總結(jié)與展望

ICP-MS作為被藥典收載的方法,不僅有助于中藥重金屬及有害元素的安全性研究,還可進一步推動其在中藥無機元素譜和元素形態(tài)及價態(tài)方面的研究,為中藥產(chǎn)地溯源、工藝監(jiān)測及質(zhì)量評價等提供科學(xué)指導(dǎo)。中藥含有的無機元素與天然有機化合物相輔相成,如能將無機元素譜和有機成分指紋譜進行關(guān)聯(lián)性研究,將能挖掘更多可用于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的信息。金屬組學(xué)是一門極具潛力的分析學(xué)科,正逐漸被中藥研究者所接受,這對于中藥安全性、有效性及相關(guān)機理的探討具有重要意義[53]。

ICP-MS技術(shù)具有較強的拓展性,新技術(shù)和新方法正在不斷地被開發(fā)應(yīng)用,如:單顆粒ICP-MS(SP-ICP-MS)已經(jīng)實現(xiàn)對部分金屬元素納米顆粒的測定[54];激光剝蝕作為ICP-MS 的進樣系統(tǒng),已用于生物或組織的元素質(zhì)譜成像研究[55-56];HPLCICP-MS已經(jīng)向多元素形態(tài)及價態(tài)分析方向拓展[57]。這些技術(shù)或?qū)橹兴幬镔|(zhì)基礎(chǔ)、有效性和安全性研究開辟新領(lǐng)域。