張雨凝 何敏 韋靖婧 郭熙艷

摘要： 為探索茜草制訶子對(duì)免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊T-bet及GATA-3表達(dá)量的影響，以茜草制訶子為研究對(duì)象，選用160羽21日齡健康中國黃羽鵪鶉，隨機(jī)分為8組，進(jìn)行臨床觀察、蘇木精-伊紅（HE）染色、熒光定量PCR等試驗(yàn)。臨床觀察結(jié)果顯示，訶子組及茜草制訶子組平均日增質(zhì)量增幅較空白組略小，但較陰性組增幅明顯較大。各組法氏囊HE染色結(jié)果顯示，訶子組及茜草制訶子組相較于空白組淋巴濾泡面積減小、法氏囊皺襞高度降低，但均優(yōu)于陰性組。T-bet和GATA-3表達(dá)量趨勢(shì)均為空白組>茜草制訶子2 g/kg組>訶子1 g/kg組>茜草制訶子4 g/kg組>茜草制訶子1 g/kg組>訶子2 g/kg組>訶子4 g/kg組>陰性組。說明，訶子及茜草制訶子均對(duì)免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊的免疫功能有恢復(fù)作用，茜草制訶子治療效果優(yōu)于訶子。研究結(jié)果為探索關(guān)于治療免疫抑制疾病、提高動(dòng)物自身免疫功能的藥物提供了一些理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 茜草制訶子;免疫抑制;中國黃羽鵪鶉;法氏囊

中圖分類號(hào)： R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）03-0704-06

Effects of Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula on expression of T-bet and GATA-3 in bursa of Fabricius of Chinese Yellow Quail

ZHANG Yu-ning1，2， HE Min1，2， WEI Jing-jing1，2， GUO Xi-yan1，2

（1.College of Veterinary Medicine， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China;2.Key Laboratory of Animal Diseases and Human Health of Sichuan Province， Chengdu 611130， China）

Abstract：To explore the effect of Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula on the expression of T-bet and GATA-3 in bursa of Fabricius of immunosuppressed Chinese Yellow Quail， Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula was used as the research object， 160 21-day-old Chinese Yellow Quails were randomly divided into eight groups to do clinical observation， hematoxylin-eosin （HE） staining， fluorescence quantitative PCR and other experiments. Results of clinical observation showed that， the daily weight gains of Terminalia chebula group and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula group were slightly lower than that of blank group， but were obviously higher than that of negative group. HE staining results of bursa of Fabricius showed that， compared with the blank group， the area of lymphoid follicle and the height of Fabricius plica of Terminalia chebula group and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula group decreased， but they were improved compared with the negative group. The expression trends of T-bet and GATA-3 were blank group> Rubia cordifolia L per Terminalia chebula 2 g/kg group> Terminalia chebula 1 g/kg group > Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula 4 g/kg group> Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula 1 g/kg group> Terminalia chebula 2 g/kg group> Terminalia chebula 4 g/kg group> negative group. The results show that both Terminalia chebula and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula can recover the immunosuppressed bursa of Fabricius of Chinese Yellow Quail， and compared with Terminalia chebula， Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula has a better effect. It provides some theoretical basis for the exploration of drugs for treating immunosuppressive diseases and improving animal autoimmunity.

Key words： Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula;immunosuppression;Chinese Yellow Quail;bursa of Fabricius

茜草（Rubia cordiforlia L.）為植物茜草的干燥根和莖[1]。訶子（Terminalia chebula）為使君子科植物訶子或絨毛訶子的干燥成熟果實(shí)[2]。訶子作為主藥、茜草作為輔藥的配伍炮制方法在藏藥方劑中早有記錄[3]，兩者可相輔相成。中國黃羽鵪鶉（Chinese Yellow Quail）是經(jīng)選育培養(yǎng)成功的品種，因其生命力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，在育種、生產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)等方面都具有很高的價(jià)值[4]。法氏囊（Bursa of Fabricius， BF）作為禽類特有的中樞免疫器官，現(xiàn)有研究主要集中于其結(jié)構(gòu)與功能發(fā)育、免疫功能的調(diào)控以及傳染性法氏囊病[5]。雖然人們已對(duì)禽類廣泛接種各類型疫苗進(jìn)行傳染病防治，但生產(chǎn)實(shí)踐中仍然有免疫抑制病大面積暴發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

T-bet主要表達(dá)于T細(xì)胞特別是Th1細(xì)胞;GATA-3表達(dá)于Th2細(xì)胞，正性調(diào)控Th2發(fā)育[7-8]。T-bet與GATA-3的表達(dá)量往往被分別用來代表Th1及Th2的表達(dá)水平，T-bet與GATA-3的比值也同時(shí)用來反映Th1與Th2的比值，Th1/Th2可決定機(jī)體免疫反應(yīng)的類型[8-9]。通過研究Th1/Th2細(xì)胞亞群漂移狀態(tài)與疾病的關(guān)系及其發(fā)生機(jī)制，我們能夠選擇性地調(diào)節(jié)Th1或Th2的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)其漂移狀態(tài)，從而達(dá)到治療某些特定疾病的目的[10]。

目前訶子及訶子炮制品對(duì)于免疫系統(tǒng)影響的研究還不完善，針對(duì)茜草制訶子的研究較少，更未有以鵪鶉法氏囊為主體的研究。本試驗(yàn)通過對(duì)中國黃羽鵪鶉注射環(huán)磷酰胺形成免疫抑制狀態(tài)，再分別通過灌胃中國黃羽鵪鶉訶子或茜草制訶子來進(jìn)行治療，進(jìn)行臨床觀察、HE染色法（蘇木精-伊紅染色法）、熒光定量PCR等試驗(yàn)，研究茜草制訶子對(duì)免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊的影響，為探索關(guān)于治療免疫抑制疾病、提高動(dòng)物自身免疫功能的藥物提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 21日齡中國黃羽鵪鶉160羽（雌雄各半），購自成都市大安鵪鶉養(yǎng)殖社。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 訶子、茜草購于成都荷花池中藥材市場(chǎng)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生藥學(xué)教師范巧佳副教授通過品種鑒別、質(zhì)量和純度分析鑒定為使君子科植物訶子（Terminalia chebula）和茜草科植物茜草（Rubia cordifolia L.），環(huán)磷酰胺購自源葉生物有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 蘇木精-伊紅（HE）染液購自索來寶生物科技有限公司;熒光定量PCR試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司。

石蠟切片機(jī)（RM2235型）、光學(xué)顯微鏡（BX53型）、烘箱（DHG-9140A型）、顯微成像系統(tǒng)（BX61VS型）、數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（HH-S6型）、熒光定量PCR儀（LightCycler 96型）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)選用160羽21日齡健康中國黃羽鵪鶉，隨機(jī)分為8組，每組20羽，分別為空白組、陰性組、訶子1 g/kg組、訶子2 g/kg組、訶子4 g/kg組、茜草制訶子1 g/kg組、茜草制訶子2 g/kg組及茜草制訶子4 g/kg組，具體處理見表1。試驗(yàn)期為10 d，試驗(yàn)前所有處理的中國黃羽鵪鶉按籠稱質(zhì)量，計(jì)算初始平均體質(zhì)量，用于計(jì)算給藥劑量。1～3 d除空白組外其他組按每羽80 mg/kg劑量肌肉注射環(huán)磷酰胺，空白組注射等量生理鹽水。4～10 d全部停止注射，訶子組及茜草制訶子組按3個(gè)不同藥量分別灌胃訶子或茜草制訶子，空白組與陰性組灌胃等量生理鹽水。試驗(yàn)期間自由采食與飲水，以上藥物灌胃量以及環(huán)磷酰胺注射量均參考前人研究結(jié)果[11-12]。

1.2.2 臨床觀察 試驗(yàn)期間每天09∶00對(duì)中國黃羽鵪鶉的精神狀況、活動(dòng)情況進(jìn)行臨床觀察。試驗(yàn)過程中以單個(gè)籠為單位記錄各組中國黃羽鵪鶉平均日增質(zhì)量變化。

1.2.3 HE染色 每組抽取3羽中國黃羽鵪鶉后采集法氏囊，用4%多聚甲醛固定，制作常規(guī)石蠟組織切片進(jìn)行HE染色。利用光學(xué)顯微鏡，在400倍視野下觀察法氏囊結(jié)構(gòu)變化。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，在100倍視野下，對(duì)各組法氏囊的皺襞高度以及淋巴濾泡的面積進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)T-bet及GATA-3表達(dá)量變化 據(jù)熒光定量PCR對(duì)引物的要求，利用NCBI在線資源查找GATA-3、T-bet和β-actin的基因序列，以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)并合成引物（表2），每組抽取3羽中國黃羽鵪鶉并摘取法氏囊，冷凍研磨法氏囊組織，并進(jìn)行RNA的提取。參照PrimeScriptTMRT試劑盒說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，得到cDNA后，參照購買公司說明書具體步驟進(jìn)行免疫相關(guān)基因的熒光定量PCR檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，P≤0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察

2.1.1 生長(zhǎng)狀況 中國黃羽鵪鶉試驗(yàn)期間空白組采食飲水、活動(dòng)狀況、精神狀態(tài)均表現(xiàn)良好;注射環(huán)磷酰胺期間，除空白組外均出現(xiàn)喜臥現(xiàn)象;灌胃相應(yīng)劑量訶子或茜草制訶子后，訶子處理組及茜草制訶子處理組精神恢復(fù)正常，活動(dòng)狀況良好，眼觀兩組間無明顯區(qū)別。

2.1.2 平均日增質(zhì)量 各組中國黃羽鵪鶉平均日增質(zhì)量見表3，空白組平均日增質(zhì)量總體呈上升趨勢(shì)。注射環(huán)磷酰胺期間，從第2 d開始除空白組外其他各組平均日增質(zhì)量明顯下降。停止注射后，陰性組出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)且回升緩慢，訶子組及茜草制訶子組隨著灌胃期延長(zhǎng)平均日增質(zhì)量相較于陰性組回升較快。各組每日增質(zhì)量具體變化有差異，但總體呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，最后1 d平均日增質(zhì)量均高于陰性組。

2.2 法氏囊HE染色

空白組（圖1A）法氏囊組織結(jié)構(gòu)完整清晰，淋巴濾泡大多數(shù)呈長(zhǎng)橢圓形，少數(shù)為不規(guī)則多邊形，皮髓質(zhì)分界清晰，淋巴細(xì)胞排列較清晰。與空白組相比，陰性組（圖1B）組織結(jié)構(gòu)縮小甚至出現(xiàn)空洞，法氏囊皺襞排列稀疏，無明顯淋巴濾泡結(jié)構(gòu)且皮質(zhì)和髓質(zhì)不可分辨，淋巴細(xì)胞明顯減少。

訶子1 g/kg組（圖1C）法氏囊組織結(jié)構(gòu)完整清晰，淋巴濾泡呈長(zhǎng)橢圓形且結(jié)構(gòu)規(guī)則，皮髓質(zhì)分界清晰，淋巴細(xì)胞排列較清晰，眼觀淋巴細(xì)胞少于空白組。訶子2 g/kg組（圖2D）與訶子1 g/kg組相比，淋巴濾泡排列稀疏且體積縮小，間質(zhì)增寬。訶子4 g/kg組（圖1E）淋巴濾泡為不規(guī)則多邊形，皮質(zhì)和髓質(zhì)邊界已很難區(qū)分，間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松紊亂且出現(xiàn)退化，淋巴細(xì)胞減少，其狀態(tài)更趨近于陰性組法氏囊。

茜草制訶子1 g/kg組（圖1F）法氏囊組織結(jié)構(gòu)完整，淋巴細(xì)胞排列清晰。茜草制訶子2 g/kg組（圖1G）法氏囊與空白組相近，與空白組相比淋巴濾泡面積較小，與茜草制訶子1 g/kg組相比皮質(zhì)增厚，淋巴細(xì)胞增多。茜草制訶子4 g/kg組（圖1H）與茜草制訶子2 g/kg組相比法氏囊內(nèi)細(xì)胞明顯減少，皮質(zhì)變薄，染色偏淺。

各組間法氏囊皺襞的高度及淋巴濾泡面積趨勢(shì)（表4）均為空白組>茜草制訶子2 g/kg組>訶子1 g/kg組>茜草制訶子4 g/kg組>茜草制訶子1 g/kg組>訶子2 g/kg組>訶子4 g/kg組>陰性組。其中在法氏囊皺襞高度上，空白組比陰性組極顯著升高（P<0.01），訶子1 g/kg組、茜草制訶子各組比陰性組顯著升高（P<0.05）。在法氏囊淋巴濾泡面積上，空白組、訶子1 g/kg組比陰性組極顯著增大（P<0.01），茜草制訶子2 g/kg組、茜草制訶子4 g/kg組比陰性組顯著增大（P<0.05）。

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)T-bet及GATA-3表達(dá)量變化

由表5可知，T-bet 與GATA-3表達(dá)量的組間變化趨勢(shì)相一致，即空白組>茜草制訶子2 g/kg組>訶子1 g/kg組>茜草制訶子4 g/kg組>茜草制訶子1 g/kg組>訶子2 g/kg組>訶子4 g/kg組>陰性組。其中，茜草制訶子1 g/kg組T-bet表達(dá)量比陰性組極顯著升高（P<0.01），除茜草制訶子4 g/kg組與訶子4 g/kg組外，其他處理組T-bet表達(dá)量均比陰性組顯著升高（P<0.05）。訶子1 g/kg組、訶子2 g/kg組GATA-3表達(dá)量比陰性組極顯著升高（P<0.01），其他組GATA-3表達(dá)量與陰性組對(duì)比均顯著升高（P<0.05）。

3 討論

3.1 法氏囊HE染色

環(huán)磷酰胺具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，對(duì)B淋巴細(xì)胞的抑制作用明顯[13]，可使法氏囊皮質(zhì)變薄，皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞減少，皮髓分界不清[14]。本試驗(yàn)中陰性組法氏囊結(jié)構(gòu)變化均可與以上已有報(bào)道相對(duì)應(yīng)，證明本試驗(yàn)過程中環(huán)磷酰胺對(duì)中國黃羽鵪鶉形成的免疫抑制效果明顯。反觀訶子組與茜草制訶子組法氏囊微觀結(jié)構(gòu)，雖不及空白組，但均優(yōu)于陰性組且差異顯著，表明訶子與茜草制訶子均可促進(jìn)法氏囊組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。中藥中含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、免疫活性物質(zhì)和抗菌物質(zhì)，可通過促進(jìn)免疫細(xì)胞活性來增強(qiáng)家禽的免疫功能[15-17]。推測(cè)訶子及茜草制訶子中含有的某些成分改善了法氏囊組織結(jié)構(gòu)，提高了免疫功能。

具體比較訶子組與茜草制訶子組，由于未經(jīng)炮制的訶子具有一定的毒性，故在本試驗(yàn)中訶子組法氏囊皺襞的高度以及淋巴濾泡的面積與劑量呈負(fù)相關(guān)。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，訶子2g/kg、訶子4g/kg 2個(gè)劑量組在第4 d平均日增質(zhì)量出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。推測(cè)是訶子具有免疫增強(qiáng)的作用，但動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)制被激活后，會(huì)使部分營(yíng)養(yǎng)素用于免疫反應(yīng)和抵抗疾病，而不是用于生長(zhǎng)，也就是在免疫功能增強(qiáng)的狀態(tài)下，動(dòng)物機(jī)體分解代謝水平升高[18-19]。但茜草制訶子組在增強(qiáng)免疫的過程中沒有出現(xiàn)體質(zhì)量負(fù)增長(zhǎng)，是因?yàn)檐绮葜圃X子經(jīng)過炮制后訶子中鞣質(zhì)或多酚含量發(fā)生變化，也或許是茜草與訶子相互作用生成了某種新成分，使藥效增強(qiáng)并且減少訶子直接入藥帶來的副作用[20]。由此可見，茜草制訶子對(duì)中國黃羽鵪鶉法氏囊的藥效比訶子更明顯。

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果分析

3.2.1 熒光定量PCR檢測(cè)法氏囊T-bet及GATA-3表達(dá)量變化 試驗(yàn)中，訶子及茜草制訶子組T-bet及GATA-3各自的相對(duì)表達(dá)量雖不及空白組但均高于陰性組，證明訶子及茜草制訶子均可在一定程度上緩解環(huán)磷酰胺對(duì)T-bet及GATA-3表達(dá)的抑制作用。因?yàn)樵X子及茜草制訶子含有減輕環(huán)磷酰胺對(duì)基因損傷作用的成分，并可以促進(jìn)基因的自我修復(fù)，具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力等功效[21-22]。

雖然中藥可以減輕環(huán)磷酰胺對(duì)基因造成的損傷，但中藥劑量過大會(huì)導(dǎo)致藥物毒副作用增大[23]。故本試驗(yàn)中訶子雖然有拮抗環(huán)磷酰胺的作用，但隨著訶子用藥劑量的增加其副作用也逐漸增大，T-bet及GATA-3的相對(duì)表達(dá)量與藥劑用量呈現(xiàn)反比。反觀茜草制訶子組，在2 g/kg劑量下T-bet及GATA-3表達(dá)量最高，雖然茜草制訶子4 g/kg組的表達(dá)量也有所下降，但其表達(dá)量均高于訶子2 g/kg組以及訶子4 g/kg組。這是由于藥物炮制是傳統(tǒng)中藥湯劑制作過程中的重要環(huán)節(jié)，科學(xué)合理的藥物炮制不僅可以降低藥材內(nèi)所含的毒性成分，還可使藥物的療效得到有效提升[24-26]。

3.2.2 對(duì)比中國黃羽鵪鶉法氏囊T-bet及GATA-3的表達(dá)量 Th2類細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，而法氏囊中的B淋巴細(xì)胞參與并介導(dǎo)體液免疫，故各組GATA-3的表達(dá)量要高于T-bet的表達(dá)量。但在訶子組中對(duì)比T-bet和GATA-3的表達(dá)量可以發(fā)現(xiàn)，T-bet與GATA-3的比值越來越大，甚至訶子4 g/kg組T-bet的表達(dá)量高于GATA-3的表達(dá)量。推測(cè)未經(jīng)過炮制的訶子對(duì)中國黃羽鵪鶉的調(diào)節(jié)可能更偏向于Th1方向。

反觀茜草制訶子組，可以發(fā)現(xiàn)茜草制訶子各組GATA-3的表達(dá)量均高于T-bet的表達(dá)量。也可推測(cè)，未經(jīng)炮制的訶子其藥物副作用對(duì)于體液免疫的影響更為明顯，故導(dǎo)致訶子組T-bet與GATA-3的比值與劑量呈正相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致Th1/Th2的漂移偏向于Th1。茜草制訶子可使漂移偏向于Th2是因?yàn)镚ATA-3可通過促進(jìn)Th2細(xì)胞中IL-4、IL-10和IL-13的表達(dá)以活化STAT6來進(jìn)一步增強(qiáng)GATA-3的表達(dá)，并通過抑制IL-12和INF-γ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制Th1細(xì)胞發(fā)育[27-29]，甚至將GATA-3轉(zhuǎn)入在Th1誘導(dǎo)環(huán)境下的T細(xì)胞中或者是已經(jīng)終末分化的Th1細(xì)胞中也能導(dǎo)致Th2細(xì)胞特異性的染色質(zhì)重塑[30-31]。

4 結(jié)論

訶子與茜草制訶子對(duì)免疫抑制中國黃羽鵪鶉法氏囊的免疫功能均有促進(jìn)作用，但訶子未經(jīng)炮制會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體有一定的毒副作用，隨著劑量的增加毒副作用增強(qiáng)，而訶子經(jīng)過茜草炮制后其毒副作用有所降低，且茜草制訶子對(duì)法氏囊免疫功能的促進(jìn)作用優(yōu)于訶子。本研究是對(duì)茜草制訶子研究的補(bǔ)充，也可為探索關(guān)于治療免疫抑制疾病、提高動(dòng)物自身免疫功能的藥物提供一些理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）