彭凌 林錦銓 李玲慧 劉博婷 蔡鞏林

摘要： 本研究測(cè)定豬丹毒絲菌臨床毒株SG7的全基因組序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)定的全基因組序列及豬丹毒絲菌表面保護(hù)性抗原A基因（SpaA）進(jìn)行分析。SG7菌株的基因組全長(zhǎng)為1 834 291.00 bp，G+C含量為36.3%，基因總數(shù)1 846個(gè)。將SG7菌株與GenBank中8條完整的豬丹毒絲菌全基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外不同菌株間基因組的基本信息存在不同程度差異?；谌蚪M單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，9株菌株聚為3個(gè)分支，國(guó)內(nèi)菌株并不完全處于同一分支，SG7菌株與國(guó)內(nèi)常見(jiàn)菌株不屬于同一進(jìn)化分支。SpaA基因高變區(qū)的分析結(jié)果顯示，9株菌株亦可分為3個(gè)SpaA型，SG7菌株為攜帶Met203的高致病性菌株。除SG7菌株外，其他8株菌株的SpaA基因分型結(jié)果與基于全基因組SNPs分析的結(jié)果一致，說(shuō)明SG7菌株的遺傳背景復(fù)雜。本研究結(jié)果可為豬丹毒絲菌基因組整體水平研究和疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 豬丹毒絲菌;全基因組測(cè)序;表面保護(hù)性抗原A（SpaA）

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）03-0694-05

Whole-genome sequencing and SpaA gene analysis of a Erysipelothrix rhusiopahiae strain

PENG Ling， LIN Jin-quan， LI Ling-hui， LIU Bo-ting， CAI Gong-lin

（Henry Fok College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan 512005， China）

Abstract： In this study， the whole genome sequence of Erysipelothrix rhusiopahiae clinical strain SG7 was determined， and the whole genome sequence and the surface protective antigen A （SpaA）gene were analyzed using bioinformatics method. The full length of SG7 genome was 1 834 291.00 bp， and the total quantity of the predicted genes were 1 846 with a G+C content of 36.3%. Different degrees of differences of genomic basic information between different strains were found by comparing the complete genome sequences of SG7 and eight E. rhusiopahiae found in GenBank. Phylogenetic analysis based on genome-wide single nucleotide polymorphisms （SNPs） revealed that nine strains could be clustered into three distinct clades， and strains isolated from China were not in the same clade， while SG7 and common strains isolated from China did not belong to the same clade. The analysis results of hypervariable region of SpaA showed that nine strains could also be divided into three SpaA types， and SG7 was a highly pathogenic strain carrying Met203. Except for SG7， the SpaA genotyping results of other eight strains were consistent with the analytic results obtained based on the genome-wide SNPs analysis， which indicated that the genetic background of SG7 was complex. The results can provide data basis for the research at the whole genome level and development of E. rhusiopahiae vaccine.

Key words： Erysipelothrix rhusiopahiae;whole-genome sequencing;surface protective antigen A （SpaA）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopahiae）又稱(chēng)紅斑丹毒絲菌，屬于丹毒絲菌屬（Erysipelothrix），呈纖細(xì)桿狀，是一種革蘭氏陽(yáng)性的人畜共患病病原菌。豬丹毒是由豬丹毒絲菌引發(fā)的一種急性、熱性傳染病，能導(dǎo)致家禽、畜類(lèi)的一系列皮膚感染及敗血癥。人類(lèi)因外傷局部感染豬丹毒絲菌，會(huì)發(fā)生類(lèi)丹毒，感染時(shí)手指出現(xiàn)斑點(diǎn)或腫起[1-2]。在20世紀(jì)80至90年代，豬丹毒與豬肺疫、豬瘟并稱(chēng)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)三大傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失并影響人類(lèi)健康[3]。近年來(lái)，豬丹毒在中國(guó)多個(gè)省份均有發(fā)生，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[4]。

目前預(yù)防和控制豬丹毒疫病的主要手段是接種疫苗，傳統(tǒng)疫苗雖然對(duì)豬丹毒的預(yù)防起到一定作用，但仍有保護(hù)率低、保護(hù)周期短等缺點(diǎn)。細(xì)菌的毒力因子是人們研制新型疫苗的標(biāo)靶[5]。有研究結(jié)果表明，豬丹毒絲菌表面保護(hù)性抗原A（SpaA）是其重要的毒力因子[6-7]，可以通過(guò)介導(dǎo)豬丹毒絲菌與豬內(nèi)皮細(xì)胞的黏附而侵入宿主發(fā)揮作用[7]。同時(shí)亦有很多研究結(jié)果證實(shí)了SpaA蛋白的N端區(qū)域?yàn)槊庖弑Ｗo(hù)區(qū)，對(duì)豬丹毒絲菌毒株有良好的免疫保護(hù)作用[8-10]。全基因組測(cè)序是通過(guò)DNA測(cè)序儀對(duì)物種基因進(jìn)行測(cè)序的一種生物信息學(xué)手段，全基因組測(cè)序分辨率高、分析速度快，為傳染性疾病的調(diào)查提供了新的方法，對(duì)疫病監(jiān)測(cè)具有重要的指導(dǎo)意義[11]。本研究擬通過(guò)測(cè)定分離自廣東省韶關(guān)市的豬丹毒絲菌毒力菌株SG7[12]的全基因序列，利用相關(guān)軟件進(jìn)行全基因組的注釋分析，并分析SpaA的遺傳多樣性，以期為豬丹毒絲菌的后續(xù)研究提供有利的數(shù)據(jù)支撐，也為新型亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)和改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

從廣東省韶關(guān)市某豬丹毒發(fā)病豬場(chǎng)分離獲得豬丹毒絲菌菌株SG7，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)鑒定為毒力菌株，半致死量（LD50）為7.3×103CFU[12]。

1.2 基因組的測(cè)序與注釋

將得到的豬丹毒絲菌DNA樣品進(jìn)行Illumina HiseqTM測(cè)序，獲得原始圖像數(shù)據(jù)，再經(jīng)過(guò)堿基識(shí)別得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。但鑒于Illumina測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤會(huì)對(duì)最終的分析結(jié)果造成影響，為了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過(guò)軟件FastQC對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行可視化評(píng)估，再利用軟件Trimmomatic[13]過(guò)濾原始數(shù)據(jù)，以保證信息分析的準(zhǔn)確性。使用軟件SPAdes[14]對(duì)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，然后對(duì)拼接得到的重疊群進(jìn)行填補(bǔ)空隙。在修正拼接過(guò)程中，產(chǎn)生剪輯錯(cuò)誤及小片段插入缺失會(huì)影響分析的準(zhǔn)確性，因此需要采用軟件PrInSeS-G[15]進(jìn)行序列矯正，得到最終的結(jié)果。拼接結(jié)果采用軟件Prokka[16]進(jìn)行基因元件的分析預(yù)測(cè)，同時(shí)利用軟件RepeatModeler鑒定SG7基因組上的重復(fù)序列。最后，采用軟件NCBI Blast+將蛋白質(zhì)氨基酸序列與COG、KEGG、VFDB等數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，獲得蛋白質(zhì)功能注釋信息。

1.3 SpaA基因堿基序列分析

從測(cè)定的SG7菌株以及GenBank上公布的豬丹毒絲菌全基因組序列中提取SpaA基因堿基序列，并翻譯為氨基酸序列，根據(jù)前人描述的方法[17-18]分析SpaA基因432 bp高變區(qū)對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)N端的氨基酸序列。

1.4 SG7菌株與其他豬丹毒絲菌的比較基因組學(xué)分析

對(duì)SG7菌株與GenBank上公布的豬丹毒絲菌完整的全基因組序列進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，并構(gòu)建基于全基因組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬丹毒絲菌菌株SG7基因組的基本特征

表1顯示，豬丹毒絲菌菌株SG7的基因組全長(zhǎng)為1 834 291.00 bp，G+C含量為36.30%。組分分析發(fā)現(xiàn)，基因總數(shù)為1 846個(gè)，堿基數(shù)為1 685 442.00個(gè)，基因平均長(zhǎng)度為913.02 bp，占基因組全長(zhǎng)的91.89%，蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)數(shù)為1 755個(gè)。采用軟件Aragorn預(yù)測(cè)tRNA，預(yù)測(cè)數(shù)為55個(gè)，采用軟件RNAmmer預(yù)測(cè)rRNA，預(yù)測(cè)數(shù)為3個(gè)。利用軟件RepeatModeler對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，SG7菌株共有107個(gè)平均長(zhǎng)度為170.30 bp的重復(fù)序列，其中DNA重復(fù)元件有19個(gè)，低復(fù)雜度序列有12個(gè)，微衛(wèi)星DNA序列有76個(gè)。

2.2 豬丹毒絲菌菌株SG7全基因組的注釋

在豬丹毒絲菌菌株SG7已經(jīng)預(yù)測(cè)的1 755個(gè)基因中，有1 316個(gè)基因注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)中[19]，占預(yù)測(cè)基因的74.99%，將這些基因信息依據(jù)COG分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)，可分為19類(lèi);有1 079個(gè)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中[20]，占預(yù)測(cè)基因的61.48%，可將這些基因劃分為24類(lèi)代謝通路。

VFDB[21]是專(zhuān)門(mén)用于研究致病因子的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括SetA和SetB 2部分。將豬丹毒絲菌菌株SG7預(yù)測(cè)得到的基因堿基序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，把基因和其相對(duì)應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來(lái)，有108個(gè)基因注釋到SetA數(shù)據(jù)庫(kù)，有114個(gè)基因注釋到SetB數(shù)據(jù)庫(kù)。

CARD[22]是耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)，能為藥物作用研究以及環(huán)境治理提供研究依據(jù)。將豬丹毒絲菌菌株SG7預(yù)測(cè)得到的基因堿基序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，有23個(gè)基因注釋到CARD數(shù)據(jù)庫(kù)。

PHI-base[23]是病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫(kù)，用于尋找藥物干預(yù)的靶基因。將豬丹毒絲菌菌株SG7預(yù)測(cè)得到的基因堿基序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列與PHI-base數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，有34個(gè)基因注釋到PHI-base數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3 豬丹毒絲菌SpaA基因分析

當(dāng)前GenBank上公布的豬丹毒絲菌完整基因組序列共有8條，從SG7和GenBank中的8株豬丹毒絲菌的基因組序列中提取SpaA基因432 bp高變區(qū)，并對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)的N端進(jìn)行分析，結(jié)果表明，9個(gè)菌株中有5個(gè)菌株為Met203/Ile257型，3個(gè)菌株為Ile203/Ile257型，1個(gè)菌株為Ile203/Leu257型。

2.4 SG7菌株與其他豬丹毒絲菌全基因組的比較分析

將SG7菌株與GenBank中8株豬丹毒絲菌菌株的全基因組基本信息進(jìn)行比較，結(jié)果（表2）顯示，豬丹毒絲菌全基因組長(zhǎng)度為1 752 910～1 945 690 bp，G+C含量維持在36.3%～36.6%，基因數(shù)保持在1 708～1 915個(gè)，而蛋白質(zhì)數(shù)為1 390～1 801個(gè)，表現(xiàn)出較大差異;tRNA保持在55個(gè)左右，但不同菌株中的rRNA數(shù)量差異較大，SG7的rRNA僅為3個(gè)，數(shù)量遠(yuǎn)低于其他菌株。9個(gè)菌株的共有基因?yàn)? 234個(gè)，特有基因?yàn)?93個(gè)。

將上述8株菌株與SG7菌株的全基因組進(jìn)行比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖（圖1），該進(jìn)化樹(shù)含有3個(gè)分支，SG7菌株與英國(guó)分離株NCTC8163、韓國(guó)分離株KC-Sb-R1、中國(guó)南京分離株SY1027同處一個(gè)分支;而其他4個(gè)國(guó)內(nèi)分離株處于第二分支;日本分離株Fujisawa單獨(dú)為一個(gè)分支。

3 討論

豬丹毒作為一種人畜共患病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失并影響人類(lèi)健康，該病的主要預(yù)防手段是疫苗接種，但傳統(tǒng)滅活疫苗存在免疫效果不持久，不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫等局限性[24]。豬丹毒的藥物治療大多采用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，但過(guò)分依賴(lài)抗生素，會(huì)導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)以及藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)[25-27]，有地區(qū)就曾分離出豬丹毒絲菌青霉素耐藥菌株[28]。因此，開(kāi)發(fā)更為有效的亞單位疫苗是科學(xué)防控豬丹毒的關(guān)鍵。盡管從1876年首次分離該菌至今已經(jīng)過(guò)去了100多年，但我們對(duì)豬丹毒絲菌分子機(jī)制的了解仍然十分有限[29-30]。2011年德國(guó)北部暴發(fā)大腸桿菌疫情，造成數(shù)千人感染，數(shù)十人死亡，但病原菌株的病原培養(yǎng)特性和細(xì)菌多位點(diǎn)序列分型（MLST）分析結(jié)果均與腸出血性大腸桿菌菌株相差甚遠(yuǎn)，有學(xué)者懷疑是新型的致病性大腸桿菌，經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與腸聚集性大腸桿菌的親緣關(guān)系更為接近，在進(jìn)化上處于同一分支，但在進(jìn)化過(guò)程中獲得了志賀毒素編碼基因stx2及多種耐藥基因，使其獲得了更強(qiáng)的生存能力，造成了病原菌的廣泛傳播[31]。可見(jiàn)，全基因組分析對(duì)病原菌株的監(jiān)測(cè)以及遺傳變異檢測(cè)有很大幫助，全基因組測(cè)序?yàn)槲覀儚姆肿铀窖芯控i丹毒絲菌提供了便利。

本研究測(cè)定了豬丹毒絲菌菌株SG7臨床毒株[12]全基因組序列，并通過(guò)使用相關(guān)的生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行注釋?zhuān)沂玖嗽摼甑幕蚪M結(jié)構(gòu)特征，豐富了豬丹毒絲菌的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。將SG7與GenBank上公布的8株豬丹毒絲菌完整基因組序列的基本信息進(jìn)行比較，除tRNA數(shù)和G+C含量比較一致外，基因組長(zhǎng)度、基因數(shù)、蛋白質(zhì)數(shù)、rRNA數(shù)SG7菌株與國(guó)內(nèi)外其他菌株存在不同程度的差異，這也許與不同地區(qū)飼養(yǎng)管理以及環(huán)境因素等存在差異有關(guān)。基于全基因組SNPs的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，9株菌株聚為3個(gè)分支，這與Forde等[32]、Ogawa等[18]的研究結(jié)果一致。國(guó)內(nèi)菌株并不完全處于同一分支，SG7菌株與南京分離株SY1027、英國(guó)分離株NCTC8163、韓國(guó)分離株KC-Sb-R1為同一個(gè)分支，而南寧分離株GXBY-1、成都分離株ZJ、武漢分離株WH13013、長(zhǎng)沙分離株ML101這4個(gè)國(guó)內(nèi)分離株則為另一分支，說(shuō)明國(guó)內(nèi)菌株至少有2個(gè)不同的進(jìn)化途徑，SG7菌株與英國(guó)分離株NCTC8163關(guān)系最近。SpaA高變區(qū)的氨基酸序列分析結(jié)果表明，9株菌株可分為3個(gè)SpaA型，SG7菌株和南寧分離株GXBY-1、成都分離株ZJ、武漢分離株WH13013、長(zhǎng)沙分離株ML101均為Met203/Ile257型。Uchiyama等[17]認(rèn)為攜帶Met203的分離株為高致病性菌株。Ogawa等[18]對(duì)分離自日本的34株菌株進(jìn)行分析，結(jié)果表明這些菌株的SpaA基因分型結(jié)果與基于全基因組SNPs分析獲得的分類(lèi)結(jié)果是一致的，本研究中除SG7菌株外，其他8個(gè)菌株亦如此。與SG7菌株處同一分支的其他菌株均為Ile203/Ile257型，SG7菌株為攜帶Met203的高致病性菌株（LD50為7.3×103CFU），但它與攜帶Met203的其他菌株不處于同一進(jìn)化分支，因此推測(cè)SG7菌株在進(jìn)化過(guò)程中也許與攜帶Met203的進(jìn)化分支的菌株接觸后進(jìn)行了SpaA基因的重組交換。本研究結(jié)果為豬丹毒絲菌基因組整體水平研究和亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：王 妮）