張譽寶 孫長崗

(1 青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266033； 2 山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院)

目前在全球范圍內，乳腺癌(BC)患者約占所有癌癥患者總數(shù)的1/3，是僅次于肺癌的女性第2大癌癥死亡原因[1]。盡管包括放射療法、化學療法、手術和新輔助療法在內的治療方法已經(jīng)獲得顯著成效，患者的存活率逐漸提高，但是由于副作用和多藥耐藥性等問題，高復發(fā)率和長期死亡率仍然嚴重威脅著患者健康[2-3]。因此臨床迫切需要副作用低的新型治療方法。

白花蛇舌草(HDW)作為一種傳統(tǒng)中草藥，主要功效包括清熱、排毒和祛瘀。由于具有顯著的抗腫瘤功效，在臨床上已廣泛用作多種腫瘤治療的替代藥物[4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，HDW可通過Akt/ERK信號傳導誘導線粒體介導的細胞凋亡，抑制膠質母細胞瘤的生長[5]；其提取物可以通過Ca2+/鈣蛋白酶/caspase-4途徑誘導乳腺癌細胞的凋亡[6]。半枝蓮(SB)是臨床中癌癥治療效果比較顯著的常用藥物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等多種作用[7]。HDW-SB

是中醫(yī)治療BC的常用藥對，在中醫(yī)治療癌癥的多種方劑中，均可見這兩種藥物的配伍使用，如“二白二半湯”、“肺癌輔助治療方”及“腫瘤和方”等方劑中[8-9]。其提取物可通過介導PI3K/AKT信號通路，發(fā)揮抑制人結腸癌HT29細胞的增殖、誘導細胞凋亡、阻止上皮間充質轉化(EMT)作用[10]。與單獨使用一種藥物相比，HDW和SB配伍使用增強了抗腫瘤功效[11]，但具體的分子生物學機制并不明確。因此，本研究旨在通過構建藥靶可視化網(wǎng)絡并結合分子對接技術探討HDW-SB治療BC的分子機制，為HDW-SB的臨床應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 篩選HDW-SB共同有效成分及有效成分潛在靶點基因

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)[12]獲取HDW-SB的共同有效成分，篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似度(DL)≥0.18。通過TCMSP的靶點模塊篩選出HDW-SB共同有效成分對應的潛在靶點，去重后，經(jīng)Perl(https://www.perl.org/)和UniProt(http://www.UniProt.org/)轉換為基因名稱，獲得HDW-SB有效成分的潛在靶點基因。

1.2 篩選BC組織與癌旁正常組織差異表達基因(DEGS)

通過基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取芯片GSE45827(包含130個BC組織樣本和11個癌旁正常組織樣本)，通過R平臺的limma軟件包篩選出BC組織與癌旁正常組織DEGs，篩選條件為|log2FC|≥1和P<0.05。再通過該平臺的R包提取HDW-SB共同有效成分與BC DEGs的交集，以確定HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建

將HDW-SB共同有效成分的潛在靶點基因和HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點全部輸入到STRING數(shù)據(jù)庫[13]中進行分析，預測兩者的相互作用，最小相互作用閾值為0.400，物種為“智人”。將得到的相互作用數(shù)據(jù)再輸入Cytoscape 3.7.1軟件中[14]，分別構建以下網(wǎng)絡：①BC DEGs的PPI網(wǎng)絡；②HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點的PPI網(wǎng)絡。使用CytoNCA插件對HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點PPI網(wǎng)絡中的所有基因進行拓撲分析，結果排序后，選取前15位的靶點作為候選靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用Cytoscape 3.7.1中的插件Clue Go對候選靶點從生物學過程(BP)、細胞組分(CC)以及分子功能(MF)3個層面進行GO富集分析，然后使用DAVID數(shù)據(jù)庫[15]進行KEGG通路分析。結果均以P<0.05為具有生物學意義的臨界值。

1.5 預后價值分析

用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫(含有5 143例BC組織樣本)評估候選靶點對患者總生存率(OS)和無復發(fā)生存率(RFS)的影響，獲得與不良預后密切相關的關鍵靶點。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.6 分子對接分析

用PubChem數(shù)據(jù)庫(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取HDW-SB共同有效成分的分子結構，保存為mol2格式；利用RCSB蛋白質數(shù)據(jù)庫[16](https://www.rcsb.org/)收集關鍵靶點所對應的蛋白結構信息；通過SYBYL-X軟件對關鍵靶點所對應的蛋白結構和HDW-SB有效成分的分子結構進行分子對接分析，篩選核心有效成分，以對接分數(shù)>4認為具有顯著意義。

2 結 果

2.1 HDW-SB共同有效成分及有效成分潛在靶點基因篩選結果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出HDW有效成分37種，SB有效成分94種，去重后得到25種HDW-SB共同有效成分，經(jīng)TCMSP的靶點模塊篩選并構建HDW-SB共同有效成分及其潛在靶點基因的關系圖(圖1)。圖中左邊為HDW-SB共同有效成分，右邊部分為有效成分對應的潛在靶點基因。

圖1 HDW-SB共同有效成分及其潛在靶點基因關系圖

2.2 PPI網(wǎng)絡構建

通過limma包分析獲得BC組織與癌旁正常組織DEGs 544個，包括185個上調基因和359個下調基因。通過CytoScape 3.7.1軟件構建BC DEGs的PPI網(wǎng)絡圖，包含150個節(jié)點和599條邊緣(節(jié)點與節(jié)點之間的連線)，其中藍色節(jié)點代表低表達的基因，紅色節(jié)點代表高表達的基因，節(jié)點的直徑隨邊緣數(shù)量增加而增大。通過R包對HDW-SB共同有效成分和BC DEGs取交集，顯示有15種HDW-SB共同有效成分調控了BC相關的23個潛在靶點，構建HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點PPI網(wǎng)絡圖(圖2)，其中紅色節(jié)點表示HWD-SB共同有效成分，藍色六邊形節(jié)點代表HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點，共有44條邊緣。將上面所獲得的23個靶點通過Cytoscape軟件進行拓撲分析后，位于前15位的靶點作為候選靶點蛋白，分別為ESR1、EGFR、AR、RUNX2、CCNA2、PRKCD、CHECK2、CHEK1、HSPB1、SERPINE、GSTP1、FOS、NQO1、COL1A1及ODC1。

A:BC DEGs的PPI網(wǎng)絡圖,B：HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點的PPI網(wǎng)絡圖圖2 BC DEGs及HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點的PPI網(wǎng)絡圖

2.3 候選靶點的GO富集分析和KEGG通路分析

GO富集分析結果顯示，HDW-SB候選靶點在BP層面主要富集于活性氧的反應、雌二醇反應、氧化應激反應等方面。MF層面主要富集于DNA結合轉錄激活劑活性、轉錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、激酶調節(jié)劑活性、RNA聚合酶Ⅱ基礎轉錄因子結合、轉錄共激活劑結合等方面。CC層面主要富集于囊泡腔、基底膜、轉錄因子復合物等方面。KEGG通路分析顯示，HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點主要富集于雌激素信號傳導途徑、MAPK信號通路、細胞周期、趨化因子信號通路等關鍵通路(P<0.05)。

2.4 預后價值分析

對BC的15個候選靶點進行預后價值分析顯示，HSPB1、CCNA2及NQO1與患者的OS和RFS密切相關，為與不良預后密切相關的BC關鍵靶點。

2.5 HDW-SB有效成分與BC靶點蛋白的分子對接分析

對關鍵靶點HSPB1、CCNA2和NQO1以及HDW-SB共同有效成分進行分子對接分析后顯示， HDW-SB共同有效成分中quercetin、rhamnoside以及l(fā)uteolin與BC關鍵靶點的分子對接分數(shù)最高；quercetin、rhamnoside和luteolin與HSPB1的對接分數(shù)分別為4.26、4.75、4.57；quercetin、rhamnoside以及l(fā)uteolin與CCNA2的對接分數(shù)分別為5.41、4.71、5.70；quercetin、rhamnoside和luteolin與NQO1的對接分數(shù)分別為4.41、4.88、4.77。

3 討 論

本研究運用網(wǎng)絡藥理學分析方法結合分子對接技術，揭示HDW-SB共同有效成分及其治療BC的分子機制。首先通過構建BC DEGs的PPI網(wǎng)絡和HDW-SB共同有效成分所調控的BC靶點的PPI網(wǎng)絡，篩選出23個藥物和疾病的共同靶點，再經(jīng)拓撲分析從中篩選出15個候選靶點，進一步進行預后價值分析后顯示，HSPB1、CCNA2和NQO1 3個靶點均與BC患者的OS以及RFS密切相關，可能是HDW-SB治療BC的關鍵靶點。

對KEGG通路分析顯示，MAPK信號通路與雌激素信號通路與BC的發(fā)生發(fā)展密切相關。先前研究表明，雌激素信號通路是參與ER+乳腺癌治療的重要通路之一，也是正常乳腺發(fā)育和乳腺癌發(fā)生的關鍵調節(jié)通路[17-18]。多細胞生物中細胞增殖的調控是一個復雜的過程，MAPK通路涉及一系列蛋白激酶級聯(lián)反應，在調節(jié)細胞增殖中發(fā)揮著關鍵作用[19]。此外，MAPK家族包括細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、Jun激酶(JNK/SAPK)和p38 MAPK，這些活化的激酶可以調節(jié)細胞的生長、分化、增殖、遷移以及凋亡，從而被認為是癌癥治療的潛在治療途徑[20]。

HDW-SB的有效成分quercetin是一種類黃酮化合物，廣泛存在于天然植物中，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化以及抗癌功效[21]。研究發(fā)現(xiàn)，quercetin可以有效抑制細胞周期蛋白1、p21、Twist以及磷酸化的p38 MAPK的表達，從而誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡[22]。Survivin為凋亡抑制蛋白家族的成員，與腫瘤的惡性程度和病理分型有關，其表達升高預示著患者的預后不良。研究表明quercetin可通過降低survivinmRNA的表達水平來提高BC細胞對化療的敏感性[23]。HDW-SB的有效成分rhamnoside具有顯著的抗血管生成特性，其可通過抑制血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)激酶的活化和磷酸化進程，從而對下游MAPK、絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和信號轉錄激活因子3(STAT3)起到抑制作用[24]。在癌癥進展過程中，VEGFR2在調節(jié)內皮細胞的有絲分裂和通透性中起著非常重要的作用[25]，其激活后可促進多種下游信號分子的磷酸化，包括MAPK、AKT和STAT3，從而促進腫瘤細胞的生長，以及內皮細胞的增殖、遷移和新生血管形成[26]。同時，rhamnoside還可以通過抑制VEGFR2及其下游信號調節(jié)因子的磷酸化，從而抑制腫瘤的新生血管生成，另外，luteolin是一種常見的類黃酮化合物，可誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖、轉移和新生血管生成[27]。目前研究顯示，luteolin可通過下調PI3K/AKT和MAPK/ERK通路抑制BC細胞的生長[28]。在本研究中，HDW-SB的有效成分quercetin、rhamnoside和luteolin與BC關鍵靶點對接分數(shù)最高，因此推測這3種有效成分可能是HDW-SB治療BC的核心有效成分。

研究報道，HSPB1屬于小應激蛋白家族，在IDCA乳腺癌細胞系中過表達，主要參與調節(jié)腫瘤的轉移和擴散，可以通過與細胞質受體(VEGF、FGF-2、Her2)的相互作用促進組成性細胞分裂，進一步導致MAPK/MEK/ERK通路的過度活化[29]。CCNA2在各種腫瘤中均呈現(xiàn)過表達，是高度保守的細胞周期蛋白家族成員之一。研究表明，在HT-29和HCT116大腸癌細胞系中敲除CCNA2基因后，可顯著阻滯大腸癌細胞的細胞周期，誘導細胞凋亡，并直接抑制大腸癌細胞的生長，也許該基因可有望成為大腸癌的新的生物標志物[30]。NQO1過表達與乳腺癌、結腸癌、宮頸癌、肺癌和胰腺癌的預后不良密切相關，并可通過上調X連鎖凋亡蛋白(XIAP)的穩(wěn)定性來抑制肝癌細胞的凋亡[31]。本文研究結果亦顯示，HDW-SB有效成分中的quercetin、rhamnoside和luteolin與上述3個關鍵靶點均呈現(xiàn)出較高的對接分數(shù)，提示HDW-SB可能是通過調節(jié)HSPB1、CCNA2和NQO1發(fā)揮抗BC的作用。

總之，本研究通過網(wǎng)絡藥理學、生物信息學與分子對接技術相結合的方法，全面分析了HDW-SB共同有效成分治療BC的分子機制，為揭示多組分中藥的治療機制提供了一種新的研究思路。