王慶堯 祁琳 陸敏杰 張禪那 王繼征 趙鵬

(1 青島大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，山東 青島 266071； 2 青島大學附屬醫(yī)院病理科； 3 中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點實驗室)

肥厚型心肌病(HCM)是一種常見的遺傳性心血管疾病,在我國患病率約為80/10萬[1]。HCM患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，可表現(xiàn)為無明顯癥狀、胸痛、心悸、暈厥和心源性猝死等[2]。目前認為，HCM是導致青年人或者運動員發(fā)生心源性猝死的首要原因[2]?，F(xiàn)已經(jīng)報道近30種基因與該疾病的發(fā)病相關(guān)[3],其中主要的兩個致病基因為β-肌球蛋白重鏈 (MYH7)基因以及肌球蛋白結(jié)合蛋白 (MYBPC3) 基因,目前在HCM陽性突變患者中的檢出率約為80%[4]。MYH7基因編碼的蛋白在心肌細胞舒張和收縮過程中發(fā)揮著重要作用[5]；MYBPC3基因編碼的蛋白在維持心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能中扮演重要角色[6]。臨床研究表明，MYH7基因突變的HCM患者比MYBPC3基因突變的HCM患者左心室流出道梗阻的發(fā)生率較高，發(fā)病年齡也較早[7]。另有研究表明MYH7基因突變的HCM患者臨床表型更重，預后較差[8]。兩種基因突變所致的HCM患者臨床表型存在較大差異，但具體的分子機制尚不明確。本研究通過檢測MYH7基因突變的HCM患者和MYBPC3基因突變的HCM患者心肌組織中蛋白表達譜的差異，探討兩種基因突變所致HCM患者臨床表型差異的可能原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年6月—2018年5月于中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院行改良擴大Morrow術(shù)治療的HCM患者。診斷標準為超聲心動圖顯示左室壁或室間隔的最大厚度≥15 mm；排除標準為心肌繼發(fā)性肥厚(如由主動脈狹窄、高血壓等引起)、HCM擬表型或明顯伴隨其他疾病的患者[9]。HCM患者入院時采集外周血進行基因檢測，根據(jù)攜帶致病突變基因的不同，分為MYH7組(僅攜帶MYH7基因突變的患者)33例和MYBPC3組(僅攜帶MYBPC3基因突變患者)30例。收集所有HCM患者手術(shù)過程中切除的心肌組織。本研究通過了中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院倫理委員會審查，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 定量蛋白質(zhì)組學分析

將所有HCM患者的心肌組織分別在液氮中研磨成粉末，加入組織裂解緩沖液裂解，然后使用超聲波進行充分裂解，離心后使用BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。吸取上述分離到的蛋白20 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并進行考馬斯亮藍染色。然后對提取出的蛋白質(zhì)溶液進行肽段酶解，再應(yīng)用Strata X C18(Phenomenex)進行脫鹽處理，真空干燥。加入0.5 mmol/L TEAB溶解肽段，加入乙腈溶解的TMT標記試劑室溫孵育2 h。將標記后的肽段在高pH條件下進行反向HPLC分級，選用Agilent 300Extend C18色譜柱，而后將肽段合并為18個組分，并對每一個組分分別進行真空冷凍干燥處理后，溶解于體積分數(shù)0.001的甲酸水溶液中，于超高效液相系統(tǒng)EASY-nLC 1000中分離肽段。分離后的肽段注入NSI離子源中電離后，使用Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜進行分析。將上面得到的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)在SwissProt人類數(shù)據(jù)庫(20 317條序列)中進行檢索。實驗重復3次，取每種蛋白表達水平的平均值。

1.3 心肌組織中差異表達蛋白的篩選

將MYBPC3組與MYH7組患者心肌組織中蛋白表達水平的比值作為兩組之間蛋白的差異表達量，取log2使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用雙樣本雙尾t檢驗方法推算P值。以P<0.05且差異表達量>1.2作為顯著上調(diào)的閾值，以P<0.05且差異表達量<0.83作為顯著下調(diào)的閾值。

1.4 心肌組織中差異表達蛋白的生物信息學分析

分別使用基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。再利用STRING數(shù)據(jù)庫(version 11.0)對差異表達蛋白進行蛋白相互作用分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者心肌組織中蛋白質(zhì)的鑒定與差異表達情況

將所有患者心肌組織蛋白質(zhì)裂解提取后，經(jīng)電泳和考馬斯亮藍染色后顯示，蛋白條帶清晰、無降解，相對分子質(zhì)量為10 000～200 000。所有患者的心肌組織中共鑒定到3 723種蛋白，兩組患者心肌組織中顯著差異表達的蛋白共有39種(圖1)，與MYH7組相比較，MYBPC3組患者心肌組織中15種蛋白表達上調(diào)，24種蛋白表達下調(diào)。表達上調(diào)的15種蛋白分別為驅(qū)動蛋白家族成員3B(KIF3B)、ATP合酶F(0)復合體C1亞基(ATP5G1)、內(nèi)黏蛋白(EMCN)、多剪接RNA結(jié)合蛋白2(RBPMS2)、蛋白激酶Cδ亞型(PRKCD)、Ⅺ型膠原α1鏈(COL11A1)、EMILIN-1、LRRFIP2蛋白、軟骨中間層蛋白1(CILP)、不活躍磷脂磷酸酶7(PLPP7)、輔酶Q10B(COQ10B)、EMILIN-3、蛋白酶體組裝伴侶2(PSMG2)、蛋白酶體抑制劑PI31亞基(PSMF1)及琥珀酸脫氫酶復合體組裝因子2(SDHAF2)。表達下調(diào)的24種蛋白分別為三聯(lián)組氨酸核苷酸結(jié)合蛋白2(HINT2)、免疫球蛋白λ變體2-8(IGLV2-8)、ATP合酶亞基S(ATP5S)、Rap1 GTPase激活蛋白2(RAP1GAP2)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)、小核核糖核蛋白多肽N(SNRPN)、二氫嘧啶樣蛋白3(DPYSL3)、蛋白質(zhì)透明同源物1 (DIAPH1)、AGFG1蛋白(AGFG1)、組蛋白PARylation因子1(HPF1)、核糖體蛋白L34(RPL34)、EH結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1樣蛋白1(EHBP1L1)、CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復合體亞基1(CNOT1)、真核生物翻譯起始因子2亞基2(EIF2S2)、破骨細胞刺激因子1(OSTF1)、細胞周期控制蛋白A(TMEM30A)、免疫球蛋白重鏈變體5-51(IGHV5-51)、前膠原-賴氨酸，2-酮戊二酸5-雙加氧酶1(PLOD1)、補體C9、免疫球蛋白δ重鏈、囊泡相關(guān)膜蛋白5(VAMP5)、清道夫受體家族F類成員1(SCARF1)、核糖體蛋白L29(RPL29)、內(nèi)聚蛋白亞基SA-2(STAG2)。

圖1 與MYH7組相比MYBPC3組中蛋白表達水平分布火山圖

2.2 兩組患者心肌組織中差異表達蛋白的GO富集分析結(jié)果

對兩組患者的所有39種差異表達蛋白質(zhì)進行GO富集分析，結(jié)果顯示差異表達蛋白的分子功能方面主要富集在Rho GTPase綁定、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分和SH3結(jié)構(gòu)域綁定方面；細胞成分方面主要富集在質(zhì)子運輸ATP合酶復合物、蛋白質(zhì)的細胞外基質(zhì)和膠原蛋白三聚物上；生物學過程主要富集在膜脂分布的調(diào)節(jié)、B細胞介導免疫和肌細胞分化的負調(diào)控等方面。

2.3 兩組患者心肌組織中差異表達蛋白的KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，39種差異表達蛋白主要富集于蛋白質(zhì)體內(nèi)消化吸收通路和糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路2條通路中。其中在蛋白質(zhì)消化吸收通路當中，COL11A1表達量上調(diào)， ACE2表達量下調(diào)；在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路中，DIAPH1表達量下調(diào)，PRKCD表達量上調(diào)。將表達量上調(diào)以及下調(diào)的蛋白分別導入KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析，結(jié)果顯示未能富集到任何通路。

2.4 兩組患者心肌組織中差異表達蛋白的相互作用分析結(jié)果

STRING分析結(jié)果顯示，39種差異表達蛋白中有28種蛋白與其他蛋白之間無相互作用關(guān)系，其余11種蛋白分別在4種功能網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)有相互作用關(guān)系(圖2)。圖中圓圈代表差異表達蛋白，圓圈之間的線條表示蛋白之間的路徑映射，可見蛋白之間路徑映射數(shù)量較少。

圖2 兩組中差異表達蛋白相互作用分析圖

3 討 論

蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以綜合分析蛋白質(zhì)各個方面的生物學特性，包括明確蛋白質(zhì)的功能和蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，確定蛋白質(zhì)在細胞中的定位以及翻譯后修飾水平[10]。與基因組學“靜態(tài)分析”的特點相比,蛋白質(zhì)組學的研究對象為數(shù)量巨大且呈動態(tài)變化的蛋白質(zhì)表達譜，可以分析復雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)以及可以更加系統(tǒng)地挖掘疾病的復雜致病機制[11-12]。目前，蛋白質(zhì)組學技術(shù)已經(jīng)在多種疾病的研究中得到廣泛應(yīng)用[13-15]。

SCHULDT等[16]對HCM患者的心肌組織進行蛋白質(zhì)組學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCM患者心肌組織中總α-微管蛋白和去酪化微管蛋白水平明顯高于正常健康心肌組織，提示微管的變性參與了HCM的發(fā)病機制。COATS等[9]也通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定出151種正常組與HCM組的心肌組織差異表達的蛋白，這些差異表達蛋白主要參與了肌肉收縮、鈣調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激等過程。雖然蛋白質(zhì)組學研究為探究HCM致病機制提供了科學證據(jù)，但是攜帶不同致病基因突變的HCM患者心肌組織蛋白質(zhì)表達譜是否存在差異尚缺乏科學數(shù)據(jù)。

本研究首先提取MYH7和MYBPC3基因突變HCM患者心肌組織的總蛋白，經(jīng)電泳和考馬斯亮藍染色后顯示，蛋白條帶清晰、無降解，條帶分布范圍廣，說明提取到的蛋白符合后續(xù)蛋白質(zhì)組學分析的實驗要求。對總蛋白進行蛋白質(zhì)組學分析后，共鑒定出3 723種蛋白，再從中篩選出差異表達的蛋白39種，約占所有定量蛋白數(shù)量的1%，說明兩種不同基因突變的HCM患者心肌組織中差異表達蛋白數(shù)量較少。39種中有15種差異蛋白表達上調(diào)，其中KIF3B上調(diào)的倍數(shù)最高，該蛋白在有絲分裂過程中負責囊泡運輸和膜擴張，從而調(diào)節(jié)細胞的遷移[17]；EMCN與EMILIN-1在促進腫瘤新生血管的生長和穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[18-19]；RBPMS2參與心臟發(fā)育過程，還能起到調(diào)節(jié)心肌細胞分化的功能[20]；EMILIN-3蛋白參與成骨細胞的增殖與遷移[21]；PRKCD是調(diào)控細胞增殖以及凋亡的蛋白激酶[22]；LRRFIP2蛋白主要地參與調(diào)控炎癥反應(yīng)；PSMF1參與構(gòu)成蛋白酶體抑制物，能夠發(fā)揮抑制多肽降解的作用[23]。但是，通過對所有表達量上調(diào)和下調(diào)的蛋白分別進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示均未能富集到任何通路，提示這些蛋白功能各不相同，蛋白之間可能無明確相互作用關(guān)系。STAG2是表達量下調(diào)倍數(shù)最高的蛋白，其主要參與構(gòu)成內(nèi)聚蛋白復合物，是DNA復制后染色單體內(nèi)聚所必需的復合物，同時參與有絲分裂期間紡錘體的組裝；RPL29可以調(diào)控新生血管的形成。STRING分析結(jié)果顯示差異表達蛋白之間路徑映射數(shù)量少，提示MYH7組與MYBPC3組之間差異表達蛋白相互作用關(guān)系較弱。

在差異表達蛋白相互作用分析圖中， ATP5G1和COL11A1與其他蛋白之間的路徑映射數(shù)量相對較多。ATP5G1是構(gòu)成ATP合酶的重要組成部分，在線粒體能量產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。當心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時，ATP5G1表達量升高，導致ATP合酶功能紊亂，使得心肌細胞出現(xiàn)能量代謝異常，進而影響心肌細胞正常功能。本研究的結(jié)果顯示ATP5G1蛋白表達量上調(diào)，提示ATP5G1表達量的變化可能與兩組HCM患者臨床表型差異有關(guān)。COL11A1在腫瘤細胞的增殖、遷移以及侵襲過程中扮演重要角色，且有研究表明COL11A1蛋白表達量升高往往導致預后不佳[24]。本研究結(jié)果顯示，與MYH7組相比MYBPC3組中COL11A1蛋白表達量上調(diào)，提示COL11A1可能與兩組HCM患者預后有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，不同致病基因突變的HCM患者心肌組織中肌節(jié)蛋白表達水平一致，表明基因型不同的HCM患者肌節(jié)蛋白的表達譜是一致的[25]。本研究顯示，兩組HCM患者心肌組織差異表達蛋白數(shù)量較少，而且差異表達蛋白之間缺乏明確相互作用關(guān)系，提示兩組HCM患者心肌組織蛋白表達譜差異較小。

綜上所述，攜帶MYH7或MYBPC3基因突變的HCM患者間表達水平發(fā)生顯著改變的蛋白數(shù)量較少，蛋白質(zhì)表達譜差異較小；其中ATP5G1和COL11A1蛋白可能與兩者不同臨床表型有關(guān)。