王凱 王飛 陳鑫哲 周露玙

(青島大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院，山東 青島 266021)

心血管系統(tǒng)疾病具有高發(fā)病率及高死亡率的特點[1]，而且患者發(fā)病愈來愈年輕化，對人類的生命健康造成了嚴重威脅[2]。急性心肌梗死是心血管疾病中較為嚴重的一種，早期診斷和及時治療是臨床的迫切需要。心肌梗死主要是突發(fā)的持續(xù)性缺血缺氧所導致。發(fā)生心肌梗死的時候會損傷大量的心肌細胞[3]。同時每年由于人體正常的新陳代謝與老化，心肌細胞也會出現(xiàn)持續(xù)性的損失[4]，因此針對心肌細胞壞死機制的研究顯得非常重要。

2006年ARAVIN等[5]從C57小鼠輸精管中分離出一種新型非編碼小RNA，并發(fā)現(xiàn)其可以與PIWI亞家族蛋白發(fā)生互作，遂將此類小RNA命名為piRNA。piRNA 3′端存在甲基化修飾，5′端第一個核苷酸存在尿嘧啶偏向性，同時第10位的堿基存在腺嘌呤偏向性[6]；piRNA通過DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子，在生殖系統(tǒng)中表達水平很高[7]；piRNA主要分布在常染色體上，極少一部分分布于X、Y染色體上[8]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)piRNA在細胞衰老、心血管系統(tǒng)疾病、癌癥等眾多疾病中均扮演著重要的角色[9-11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，piRNA可以通過介導mRNA表觀遺傳修飾參與調(diào)節(jié)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程[7]。但目前對于piRNA在心肌細胞壞死過程中的作用機制尚不清楚。piR-10555已被現(xiàn)有基因庫收錄，編號DQ542443。本研究通過過表達或敲低H9c2細胞piR-10555基因，探討piR-10555在H9c2細胞壞死過程中變化情況及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑來源

大鼠心肌細胞H9c2為本實驗室保存；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYRB試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購自美國賽默飛世爾科技公司；siRNA及陰性對照NC購自吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LDH測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

1.2.1細胞培養(yǎng) 將H9c2細胞置于體積分數(shù)為0.10血清及10 g/L的青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2條件下傳代培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期、生長良好的細胞，接種于培養(yǎng)板中，孵育12～48 h后，用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞壞死誘導處理 以500 μmol/L H2O2處理H9c2細胞0、6、12、24 h，具體實驗步驟參考文獻進行[12]。通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法篩選出H9c2細胞piR-10555表達差異有顯著性的時間點作為后續(xù)實驗的處理時間。

1.3 實驗分組及處理

本研究通過分別向細胞不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染NC以及轉(zhuǎn)染agomir-piR-10555將細胞分為正常對照組(A組)、NC組(B組)、過表達piR-10555組(C組)。使用RT-qPCR方法檢測各組細胞中piR-10555的相對表達水平(U6作為內(nèi)參照)，通過PI染色及LDH試劑盒測量各組細胞的壞死情況,實驗操作均嚴格按照試劑盒說明進行。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

通過分別向細胞不轉(zhuǎn)染、僅H2O2處理以及轉(zhuǎn)染NC后H2O2處理、轉(zhuǎn)染antagomir-piR-10555后H2O2處理將細胞分為正常對照組(D組)、H2O2處理組(E組)、NC+H2O2處理組(F組)以及敲低piR-10555+H2O2處理組(G組)。使用RT-qPCR方法檢測4組細胞中piR-10555的相對表達水平(U6作為內(nèi)參照)，通過檢測PI陽性染色比例及細胞培養(yǎng)基上清液中LDH的活性來測量細胞壞死情況，實驗操作均嚴格按照試劑盒說明進行。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 H2O2處理的不同時間點H9c2細胞中piR-10555的表達情況

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，H2O2處理H9c2細胞0、6、12以及24 h后，piR-10555表達水平分別為1.00±0.23、1.27±0.27、1.75±0.64、2.91±0.25，不同時間H9c2細胞中piR-10555表達差異有顯著性(F=14.51，P<0.05)；其中24 h與0 h進行比較，H9c2細胞中piR-10555表達水平具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 piR-10555對H9c2細胞壞死的調(diào)控作用

2.2.1過表達piR-10555對H9c2細胞壞死的影響實驗結(jié)果顯示，各組H9c2細胞中piR-10555表達水平、PI陽性率及細胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性比較差異有顯著性(F=32.61～154.00，P<0.05)，其中C組以上指標與A、B組比較，差異均有顯著意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 過表達實驗各組H9c2細胞內(nèi)piR-10555表達水平及細胞壞死情況比較

2.2.2敲低piR-10555對H9c2細胞壞死的影響敲低實驗結(jié)果顯示，各組H9c2細胞中piR-10555表達水平、PI陽性率及細胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性比較差異具有顯著性(F=33.31～138.70，P<0.05)，其中G組與E、F組比較，差異均有顯著意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 敲低實驗各組H9c2細胞內(nèi)piR-10555表達水平及細胞壞死情況比較

3 討 論

心肌細胞的死亡是許多心臟疾病的病理學基礎[13]。長期以來壞死被認為是細胞死亡的最主要的方式之一。過去的觀點中認為壞死不受信號通路調(diào)控，是被動的細胞死亡形式[14]。但隨著研究不斷深入，近年來發(fā)現(xiàn)細胞壞死也是一個由基因控制的高度有序的在一系列酶參與下完成的過程[15]。細胞壞死能夠幫助機體維持正常的生理功能，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[16]。然而，目前對于心肌細胞壞死的信號通路的研究還遠遠不夠深入，因此針對心肌細胞壞死的分子機制進行研究,并以此開發(fā)新的生物標志物及治療靶點具有重要意義。

A、B、C分別為A、B、C組，400倍圖1 過表達實驗各組細胞PI染色結(jié)果

D、E、F、G分別為D、E、F、G組，400倍圖2 敲低實驗各組PI染色結(jié)果

隨著表觀遺傳學和生物信息學的興起與發(fā)展，曾被認為是無用基因的非編碼基因已成為研究的前沿領域，近年來非編碼RNA也已經(jīng)成為了心血管疾病研究的熱點[17]。雖然piRNA在心臟組織中大量表達，但是其參與心臟相關(guān)各種疾病的發(fā)病機制仍不清楚[18]。piRNA可以通過與PIWI蛋白形成RNA-蛋白復合物參與基因調(diào)控[19]。在心肌細胞從多能細胞分化而來的過程中，可以觀察到動態(tài)而特異的piRNA表達模式[20]。與正常的心臟相比，發(fā)生心肌細胞肥大的心臟組織中piRNA的表達水平異常，但其功能仍不清楚[21-22]。在生殖細胞中，piRNA與PIWI蛋白一起介導轉(zhuǎn)座子和編碼蛋白基因的調(diào)控[23]。而piRNA在調(diào)控心肌細胞壞死過程中的具體作用機制研究目前還比較匱乏，所以尋找心臟組織中特異表達的并且參與調(diào)控心肌細胞死亡的piRNA，并進一步闡明其作用機制，具有重要的研究意義。

本研究通過建立H9c2細胞的壞死模型，探討piRNA在心肌細胞壞死中的機制及作用。本次實驗中所使用的agomir-piR-10555、agomir-NC-piR-10555、antagomir-piR-10555以及antagomir-NC-piR-10555為相關(guān)siRNA，通過將其轉(zhuǎn)染進細胞，以達到過表達或敲低piR-10555的目的。PI能夠標記發(fā)生壞死的細胞核，被作為一種常見的壞死檢測方式。細胞發(fā)生壞死時，胞質(zhì)酶LDH釋放到細胞外，通過檢測細胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性也可作為檢測細胞壞死的一個指標。本實驗結(jié)果顯示，在H2O2處理24 h后，H9c2細胞中piR-10555的表達水平顯著升高，因此后續(xù)實驗均選擇24 h作為細胞處理時間點。

本實驗的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染agomir-piR-10555后H9c2細胞內(nèi)piR-10555的表達水平顯著升高；通過PI染色發(fā)現(xiàn)，過表達piR-10555后PI陽性率相對于A、B組顯著升高；LDH活性檢測發(fā)現(xiàn)，在過表達piR-10555后細胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性相對于A、B組顯著升高。提示，過表達piR-10555后可以誘導心肌細胞發(fā)生壞死。轉(zhuǎn)染antagomir-piR-10555后，H9c2細胞內(nèi)piR-10555表達明顯下降；通過PI染色發(fā)現(xiàn)，敲低piR-10555后，G組的PI陽性率相對于E、F組顯著降低；LDH活性檢測發(fā)現(xiàn)，敲低piR-10555以后，G組的細胞培養(yǎng)基上清液中LDH的活性相對于E、F組顯著降低。提示，敲低piR-10555可以抑制H2O2誘導的心肌細胞的壞死。

綜上所述，piR-10555能夠參與調(diào)控由H2O2誘導的H9c2細胞的壞死。但piR-10555調(diào)控心肌細胞壞死的具體機制還有待深入研究。