編譯 希區(qū)客

2020年11月5日，以色列維茨曼研究所的羅特姆·索雷克（Rotem Sorek）團隊在《細胞》（Cell）上發(fā)表論文證實一種名為反轉(zhuǎn)錄子（Retron）的細菌的遺傳元件同樣也是細菌抵抗噬菌體的防御系統(tǒng)。那么，反轉(zhuǎn)錄子能否像CRISPR一樣，被開發(fā)成強大的基因編輯工具呢？2021年5月，哈佛醫(yī)學(xué)院喬治·丘奇（George Church）領(lǐng)銜的團隊在這方面有了新進展。

從CRISPR到重組工程

毫無疑問，CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)已成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的創(chuàng)新典范，其帶給人類的影響可用驚世駭俗來形容，但現(xiàn)階段的它仍存在技術(shù)缺陷。其中一個極為關(guān)鍵的問題在于，雖然研究者可以通過某些設(shè)定，用CRISPRCas9尋找并切割特定的目標(biāo)DNA片段，但切割之后的替換任務(wù)需要誘使細胞用新的DNA片段來修復(fù)斷裂，而這一“誘導(dǎo)+替換”的過程很復(fù)雜，甚至對細胞造成傷害（因為Cas9經(jīng)常還會切割計劃外的位點，造成脫靶問題）。

近年來興起的一項新型基因編輯技術(shù)——重組工程，似乎可彌補CRISPR的缺陷。它執(zhí)行誘導(dǎo)和替換任務(wù)的方式是在細胞復(fù)制DNA時引入目標(biāo)基因片段。所謂“復(fù)制”，即DNA的半保留復(fù)制過程本就是模板單鏈持續(xù)配對堿基最終合成出完整雙鏈分子的過程，因此在這一過程中引入目標(biāo)突變基因是相當(dāng)安全的。相比常規(guī)CRISPR的“強行替換”，重組工程選擇的“偷梁換柱”可以說是在不破壞DNA的情況下有效地產(chǎn)生了基因突變。下圖為該過程的示意圖。

反轉(zhuǎn)錄子重組過程示意圖：將含有目標(biāo)突變（圖中的黑色小段）的反轉(zhuǎn)錄子序列與反轉(zhuǎn)錄酶（RT）一起引入細菌細胞。接著，反轉(zhuǎn)錄子序列由雙鏈分出單鏈，單鏈DNA借助另一種稱為單鏈退火蛋白（SSAP）的酶插入需要引入突變的DNA序列中

此種方法簡單便捷，可同時在許多細胞內(nèi)開展，以盡可能短的時間創(chuàng)建出盡可能復(fù)雜多樣的突變庫，從而為研究人員分析所用。然而有另一個問題無法忽視：大量的突變可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)，但想弄清楚它們具體是什么，那就需要對每個突變體進行分離、測序和表征，而這是一項極為耗時費力的任務(wù)。

將重組工程升級為RLR

在此背景下，哈佛大學(xué)的Wyss研究所和哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員創(chuàng)建了一種基于反轉(zhuǎn)錄子的新型基因組編輯工具，并將其命名為“反轉(zhuǎn)錄子庫重組工程”（RLR）。RLR讓整個任務(wù)變得容易：一方面，它和普通的重組工程技術(shù)差不多，可同時生成多達數(shù)百萬個突變，快捷高效；另一方面，RLR不只產(chǎn)出突變，更能給突變“編碼”（我們可以將它類比為商品的條形碼），這便于研究者一次性地快速篩查整個基因突變池（更通俗地說就是查找變異基因的速度大大加快），進而輕松生成并分析大量數(shù)據(jù)。

已有科學(xué)家使用RLR技術(shù)在細菌細胞中完成了“百萬量級”的基因編輯，并于2021年5月4日在《美國國家科學(xué)院院刊》（PNAS）發(fā)表論文介紹了他們的工作。

論文作者之一、Wyss研究所的博士后麥克斯·舒伯特（Max Schubert）表示：“RLR讓我們有能力開展CRISPR無法完成的任務(wù)。我們隨機‘切碎’一個細菌的基因組，將基因片段原位轉(zhuǎn)化為單鏈DNA，并同時篩選數(shù)百萬個序列。RLR是一種更簡單也更靈活的基因編輯工具，可用于高度重復(fù)的實驗，這使得它不僅不像常規(guī)的CRISPR那樣具有傷害性，還可大大助力研究人員在基因組水平上探索突變?！?/p>

反轉(zhuǎn)錄子是細菌的DNA片段，可通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈DNA（ssDNA）片段?？茖W(xué)界發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄子已有數(shù)十年歷史，但這數(shù)十年來，研究人員一直不了解反轉(zhuǎn)錄子產(chǎn)生的ssDNA有什么用。直到2020年6月，終于有團隊發(fā)現(xiàn)原來單鏈DNA可以檢測出病毒是否感染了細胞，它是細菌免疫系統(tǒng)的一份子。

最初人們只把反轉(zhuǎn)錄子視為細菌的某種特例，但過去幾年間，越來越多科學(xué)家都將目光投向了這一特例，認為反轉(zhuǎn)錄子有望如CRISPR那般，在細菌、酵母菌甚至人類細胞的基因編輯方面大展拳腳。

如前文所述，將包含目標(biāo)突變的單鏈DNA片段整合至原有基因組的方式有兩種。一種是CRISPR-Cas9常用的先切割后替換，另一種則是重組工程技術(shù)（包括更高效的RLR）選擇的復(fù)制過程引入策略：先把突變序列引入細胞，令其分作單鏈，再借助單鏈退火蛋白把突變整合到基因組中。

新研究的第一作者、加州大學(xué)舊金山分校博士后研究員丹尼爾·古德曼（Daniel Goodman）指出，反轉(zhuǎn)錄對基因編輯的升級是革命性的。正因為它，我們才能先把雙鏈序列引入等待編輯的細胞，接著等待雙鏈自己分解成單鏈，最后完成替換——而不必選擇強行把單鏈導(dǎo)入細胞，不必破壞天然DNA，這著實妙。

反轉(zhuǎn)錄的另一個吸引人之處在于它們的序列本身可用作“條形碼”，以識別細菌池中的哪些個體已經(jīng)接收到了哪些反轉(zhuǎn)錄子序列，進而幫助研究者極為快速地匯總篩選突變菌株。

搭建RLR體系的全過程

為確認反轉(zhuǎn)錄子是否能實現(xiàn)高效的基因重組，舒伯特和同事首先創(chuàng)建了細菌DNA的環(huán)狀質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含位于反轉(zhuǎn)錄子序列中的抗生素抗性基因，以及一個單鏈退火蛋白（SSAP）基因。他們將這些反轉(zhuǎn)錄子質(zhì)粒插入大腸桿菌，待其經(jīng)過20代細胞復(fù)制后，觀察抗生素抗性基因是否成功整合至大腸桿菌的基因組中。他們一開始的觀察結(jié)果并不理想，整合成功的大腸桿菌的比例低于0.1%。

為提高成功率，研究團隊對細菌質(zhì)粒進行了幾項調(diào)整。一方面，他們令細菌的自然錯配修復(fù)機制（可糾正DNA復(fù)制錯誤）失活，這保證了突變不會在遺傳給下一代之前“修復(fù)”。另一方面，他們還滅活了細菌的兩個編碼核酸外切酶（可破壞自由浮動的ssDNA）基因。這些變化極大地增加了成功整合反轉(zhuǎn)錄序列的細菌比例——從原來低于0.1%增至90%以上。

在反轉(zhuǎn)錄子的基因整合方面大獲成功后，舒伯特團隊開始測試可否將反轉(zhuǎn)錄子用作基因測序的“捷徑”——由于每個細菌質(zhì)粒都有自己獨特的反轉(zhuǎn)錄序列，這些序列可以充當(dāng)“標(biāo)簽”（或者說是“條形碼”）。

此前已經(jīng)介紹過，所謂的RLR技術(shù)就是切開細菌的基因組，將其中某個基因片段原位轉(zhuǎn)化為單鏈DNA，并用它們一次性篩選數(shù)百萬個序列。這里用于篩選的片段就是那個關(guān)鍵的“條形碼”，即細菌質(zhì)粒內(nèi)某段獨特的反轉(zhuǎn)錄序列。而用RLR篩選的優(yōu)勢在于它免去了檢測細菌全基因組的海量工作，只測那段短得多的反轉(zhuǎn)錄序列即可確定細胞已經(jīng)接受了哪些突變。

舒伯特團隊的構(gòu)想相當(dāng)完美，那么在實操層面，他們是如何打造自己那一套神奇的RLR條形碼篩查體系的呢？

首先，他們測試了RLR技術(shù)能否檢測出大腸桿菌體內(nèi)已知的抗生素耐藥性突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包含耐藥性突變的序列相比其他突變在測序數(shù)據(jù)中的存在比例高得多；同時他們還確定，RLR具有足夠的靈敏度和精確度，可測量由非常相似的突變所引起的耐藥性方面的微小差異；更為重要的是，通過特定“條形碼”篩查整個細菌基因池（而非對單個突變體進行分離測序）尋找目標(biāo)突變的效率極高。

接著，研究團隊更進一步，嘗試確定RLR能否用于隨機片段化的DNA檢測篩查，以及他們一次可使用多少個反轉(zhuǎn)錄子。舒伯特等人切碎了對另一種抗生素具有高度耐藥性的大腸桿菌菌株的基因組，并利用這些片段建立了一個包含數(shù)千萬條基因序列（均來自質(zhì)粒反轉(zhuǎn)錄子序列）的庫。之后，他們將該基因庫引入經(jīng)RLR優(yōu)化的大腸桿菌菌株中進行分析，結(jié)果再一次發(fā)現(xiàn)，對細菌基因庫進行測序篩查，可以很容易地識別出賦予耐藥性的反轉(zhuǎn)錄子片段。

論文的通信作者、著名合成生物學(xué)家喬治·丘奇表示：“我們能夠通過RLR技術(shù)，基于 ‘條形碼’來分析整個突變庫，這讓同時開展數(shù)百萬次實驗成為現(xiàn)實，也幫助我們能夠觀察到整個基因組突變的影響，以及這些突變之間如何相互作用。這項工作有助于建立在其他遺傳系統(tǒng)中使用RLR的路線圖，為未來的遺傳研究打開了許多令人興奮的可能性?！?/p>

資料來源 harvard.edu