李彩明，張得寧 ，劉力寬，曲宣詔，李錦萍，龍主多杰，曾 陽,3,

（1.青海師范大學生命科學學院,青海西寧 810008；2.青海山水自然資源調查規(guī)劃設計研究院(有限合伙),青海西寧 810000；3.高原科學與可持續(xù)發(fā)展研究院,青海西寧 810008）

高血脂癥是血漿中的總膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）與低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein，LDL）或高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein，HDL）異常的一種疾病，是誘發(fā)腦卒中、冠心病、動脈脂肪變性及非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等心腦血管疾病的關鍵因素之一[1?2]。由于現(xiàn)代人的生活方式和高脂肪食品的過度攝入，導致目前高脂血癥患者的數(shù)量不斷增多且趨于年輕化，高血脂癥的發(fā)病率在普遍上升[3]。

據(jù)研究，高脂飲食導致大鼠體內脂類代謝產生次級膽酸、硫化氫等產物增多，而破壞腸道微環(huán)境[4]。腸道微生物群的生存是從機體攝入的食物中獲取營養(yǎng)和能量，同時產生代謝物，這些代謝物通過其同源受體發(fā)出信號來調節(jié)宿主代謝，膽汁酸就是一類這樣的代謝物[5]。腸道菌群可通過間接調控膽汁酸代謝中的FXR信號通路[6]，調整細胞脂肪酸的攝入來促進血脂在脂肪組織的儲存，并分泌載脂蛋白，而改善高血脂癥[7]。

金露梅（Potentilla fruticosaL.），薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬（Potentilla）落葉灌木，產自青海、陜西、甘肅、西藏等地，生于山坡草地、礫石坡、灌叢及林緣，海拔1600～4000 m。其葉、花、根及全株均可入藥[8]。《晶珠本草》記載金露梅可治婦女乳房脹滿，《全國中草藥匯編》記載其味甘、性涼，主治消化不良、浮腫、赤白帶下、乳腺炎。金露梅的根、莖、葉、花和枝都具有非常強的藥理活性[9?11]，嚴培瑛等[12?14]研究發(fā)現(xiàn)，金露梅能夠調節(jié)多種糖脂代謝相關激素的表達,部分恢復T2DM大鼠胰島素水平及其中分離的化合物有抑菌等作用。李美華等[15]發(fā)現(xiàn)，金露梅水提物、95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶的活性有較強的抑制作用，Rauf等[16]發(fā)現(xiàn)，金露梅有潛在的抗氧化特性、抗腫瘤特性和抗糖尿病作用，但是金露梅對高血脂癥的研究，目前未見報道。

因此，本研究建立飲食性高血脂癥Wistar大鼠模型，利用16S rDNA高通量測序方法檢測分析Wistar大鼠的腸道菌群變化，探討金露梅茶降血脂的可能機制，為青藏高原金露梅資源的有效合理利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金露梅嫩葉、花 采集于青海省大通達坂山（海拔3006 m，37° 8' 42" N，101° 50' 32" E），經鑒定為金露梅（Potentilla fruticosaL.）；SPF級Wistar雄性大鼠，體質量（170±10）g，批號：SCXK（京）2016-0011

購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；基礎飼料、高脂飼料 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；500 mL生理鹽水 西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；TC、TG、LDL、HDL生化試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所。

BS電子分析天平 上海友聲衡器有限公司；超低溫冰箱 Thermo Forma公司；高速冷凍離心機上海江東儀器廠；Bio-Rad XMARK全自動酶標儀美國伯樂生命醫(yī)學產品（上海）公司；連續(xù)移液槍美國TOMOS公司；一次性96 孔板 德國 Greiner公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金露梅茶及飲品的制備 課題組在傳統(tǒng)制茶工藝及相關專利基礎上稍做改進，制作金露梅茶[17]，分別稱取金露梅花茶、綠茶、紅茶各50 g，加10 倍蒸餾水于加熱套煮沸2 min，提取2 次，過濾，合并濾液，冷卻至常溫，得金露梅花茶、綠茶和紅茶飲品，每天制備新鮮金露梅茶飲品待用。

1.2.2 金露梅茶的感官檢測 樣品中的感官檢測依據(jù)本項目組制定金露梅茶企標Q/HQGQ0001S-2019 文件進行檢測。

1.2.3 金露梅茶的重金屬及水分、灰分測定 砷的測定按照GB 5009.11-2014 中茶葉類食品測定方法-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法。鉛的測定按照GB 5009.12-2017 中食品測定方法-石墨爐原子吸收光譜法。水分測定按照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定方法》測定方法-直接干燥法?；曳职凑諟蔊B 5009.4-2016《食品中灰分的測定方法》中規(guī)定的方法。

1.2.4 高血脂癥大鼠模型建立

1.2.4.1 造模方法 SPF級Wistar大鼠，普通飼料適應性喂養(yǎng)一周后稱重，分為6 組，每組8 只，其中一組繼續(xù)喂普通飼料，其余組開始喂高脂飼料。3 周后，稱體重，隨機再進行分組，除空白組外，其他各組大鼠采用特定高脂飼料進行飼養(yǎng)，并金露梅花茶、綠茶、紅茶組大鼠將飲用水換成相應的金露梅花茶、綠茶、紅茶飲品，空白、模型組給與相同量的飲用水，連續(xù)8 周，每周稱量各組大鼠體重進行監(jiān)測[18?19]。

1.2.4.2 指標測定 實驗結束后，將大鼠麻醉，在超凈工作臺上對各組大鼠進行股動脈取血，收集血樣，低溫下進行離心，取血清保存于?20 ℃冰箱。TCHO、TG、HDL-C、LDL-C含量測定參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4.3 糞便收集 實驗結束后，在超凈工作臺上，用提前消毒滅菌的凍存管收集各組大鼠糞便160 mg左右，快速置于液氮中冷凍，然后轉入?80 ℃冰箱保存。所取樣本送往北京諾禾致源科技股份有限公司進行16Sv4 區(qū)域測序分析。

測序分析過程如下：對送檢樣本進行DNA提取與檢測，然后進行PCR擴增、產物純化、文庫制備及庫檢，基于IonS5TMXL測序平臺，使用Cutadapt軟件過濾和按barcode拆分樣本后，進行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度、Alpha、Beta多樣性計算及Venn圖等分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面，根據(jù)物種注釋結果，選取每個樣品或分組在門、屬分類水平（Phylum、Genus）上最大豐度排名前10 的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在不同分類水平上，相對豐度較高的物種及其比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結果均以每組動物的平均值±SD表示。采用SPSS 17.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學評價。采用組學數(shù)據(jù)處理方法進行基于有效數(shù)據(jù)的OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類分析，再對所獲得的OTU進行Alpha多樣性和Beta多樣性計算，結合t檢驗，以P<0.05 為閾值得出代表序列的物種注釋、物種信息和基于物種的豐度分布情況。

2 結果與分析

2.1 金露梅茶的感官檢測

感官指標檢測結果為，花茶色澤標準為黃色，浸泡后湯色為黃色，紅茶、綠茶色澤標準為綠黃色，浸泡后湯色為綠黃色，均無肉眼可見外來雜質，氣味、滋味符合標準為清香醇和，滋味純正。

2.2 金露梅茶重金屬測定及水分、灰分測定

本實驗用金露梅茶的重金屬砷、鉛含量在國家安全標準范圍內，水分、灰分均符合國家標準，判定為合格，結果見表1。

表1 三種金露梅茶中水分、灰分和重金屬的含量Table 1 Contents of water,ash and heavy metals in three kinds of Potentilla fruticosa tea

2.3 大鼠的一般行為學觀察

連續(xù)喂養(yǎng)11 周后，各組大鼠體重無明顯差異，空白對照組的大鼠精神狀態(tài)良好，反應迅速敏捷，毛發(fā)有光澤，食量、排便量正常，模型組與對照組大鼠相比，精神狀態(tài)和反應明顯下降，毛發(fā)較粗糙且有少許脫落，進食量、排便量等均較對照組稍低，金露梅茶組與模型組相比，精神狀態(tài)較好、毛色光滑，反應靈敏。

2.4 血脂四項測定結果

對實驗各組大鼠血清中的TG、TC、LDL和HDL進行測定，結果見表2。由表2 可知，長期給予高脂飼料，模型組大鼠血液內TG、TC和LDL的含量較空白組明顯上升，HDL含量明顯下降。與模型組比較，金露梅花茶、綠茶、紅茶組大鼠TG、TC含量顯著下降（P<0.05 或P<0.01），LDL含量均下降，僅金露梅花茶差異顯著（P<0.05），HDL含量均升高，金露梅紅茶組差異顯著(P<0.05)。說明金露梅茶可以調節(jié)高脂血癥大鼠血液內 TG、TC、HDL、LDL的含量，課題組前期發(fā)現(xiàn)，金露梅茶能夠調節(jié)多種糖脂代謝相關激素的表達[12]，可能與金露梅茶含有豐富的營養(yǎng)物質有關。

表2 三種金露梅茶對大鼠血清生化指標的影響（n=8，x±SD）Table 2 Effects of three kinds of Potentilla fruticosa tea on serum biochemical indexes of rats（n=8，x±SD）

2.5 糞便腸道菌群16S rDNA高通量測序分析

2.5.1 各組腸道菌群總數(shù)OTU聚類與注釋結果經OTU數(shù)據(jù)為計算依據(jù)構建VENN圖進行菌群多樣定性分析發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)普通飼料組（K）與高脂飼料組（M）相比，共同含有的Core microbiome為1529 個，占到兩組總數(shù)的70.8%。表明高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8 周后，大鼠腸道菌群發(fā)生改變，有220 個OTU消失，同時產生了409 個特有的OTU。

與空白組相比，模型組OTU數(shù)升高；各給藥組菌群的OTU值與模型組相比均有所下降，但差異不顯著（P>0.05）。表明長期喂養(yǎng)高脂飼料使大鼠的腸道菌群OTU數(shù)量增加，金露梅茶干預后，OTU數(shù)量下降，說明金露梅茶的干預減少了腸道菌群的菌種數(shù)量和種類。而金露梅花茶組、綠茶組、紅茶組與正常對照組的共有序列分別為1514 條、1471 條、1489 條；同時，高血脂模型組的OTU中有3.0%在其他組中沒有出現(xiàn)，正常對照組和金露梅花茶組、綠茶組、紅茶組干預組的這一數(shù)值分別是4.2%和2.8%、7.4%、5.7%。提示高血脂模型組大鼠腸道菌群多樣性可能受到了一定影響，金露梅茶對腸道菌群具有一定的調節(jié)作用（表3、圖1）。

表3 各組細菌總數(shù)OTU聚類與注釋結果Table 3 OTU clustering and annotation results of total bacterial count in each group

圖1 不同飲食組大鼠腸道菌群Venn圖Fig.1 Venn diagram of gut microbiota of different diet groups of rats

經PCA主成分分析，高脂飲食后，模型組與空白組的主成分區(qū)域較為明顯地分開；各飲茶組與模型組主成分區(qū)域基本分開，表明不同茶組之間的腸道菌群存在差異，可調節(jié)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的腸道菌群結構（圖2）。

圖2 不同飲食組大鼠腸道菌群主成分分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of gut microbiota of different diet groups of rats

2.5.2 各組腸道微生物多樣性與豐富度分析 Alpha Diversity用于分析樣品內（Within-community）的微生物群落多樣性，可以反映樣品內的微生物群落的豐富度和多樣性。Shannon和Simpson指數(shù)是同時考慮到物種豐富度和均勻度的多樣性指數(shù)，Goods_coverage指數(shù)反應了測序的深度，稀釋曲線（Rarefaction Curve）可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度，本研究中測定結果表明各組的樣本測序深度已基本覆蓋所有樣品物種，豐富度較高（表4、圖3）。同時通過T-test檢驗，wilcox秩和檢驗和Tukey檢驗分析組間物種多樣性差異，結果顯示高血脂模型組的腸道菌群多樣性有所降低，而金露梅花茶、綠茶、紅茶對恢復菌群多樣性具有較好的調節(jié)作用，但各組間差異不顯著（P>0.05）。模型組與空白組、金露梅茶組之間腸道菌群組成結構存在明顯差異（表4、圖4）。

圖3 不同飲食組大鼠腸道菌群聚類稀釋曲線Fig.3 Cluster dilution curve of differences between groups of different diet groups of rats

圖4 不同飲食組大鼠組間差異分析的箱型圖Fig.4 Box diagram for analysis of differences between groups of different diet groups of rats

表4 Alpha Diversity分析相關指數(shù)Table 4 Alpha diversity analysis correlation index

2.5.3 各組在不同分類水平上的物種組成

2.5.3.1 門水平上各組腸道微生物豐度分析 各組大鼠腸道微生物在門水平上的構成處于前5 位的依次為：Firmicutes、Bacteroidetes、Tenericutes、Proteobacteria、unidentified_Bacteria。其 中，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidetes是腸道中的優(yōu)勢菌群，經過分析發(fā)現(xiàn)，給予金露梅茶干預后，大鼠的Firmicutes豐度較模型組有所減少，Bacteroidetes的豐度與模型組相比增加。表明飲用金露梅茶可減少高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的Firmicutes的豐度，增加Bacteroidetes的豐度（圖5A）。

2.5.3.2 屬相對豐度分析 與空白組比較，模型組大鼠腸道微生物在屬水平上的構成處于前5 位組成豐度發(fā)生明顯變化，Bacteroides、unidentified_Ruminococcaceae、unidentified_Clostridiales、Bacteroide豐度明顯上升，Lactobacillus豐度下降，經金露梅花茶、綠茶、紅茶干預后，大鼠腸道內Lactobacillus、Bacteroide豐度明顯增加，而unidentified_Ruminococcaceae、unidentified_Lachnospiraceae豐度則明顯下降（圖5B）。

圖5 大鼠腸道微生物相對豐富度Fig.5 Relative abundance of gut microbiota at species level of rats

3 討論與結論

在中國，茶文化已有數(shù)千年，深刻影響著人們的生活習慣。在本研究中，模擬人飲茶習慣，分別給與大鼠普通飲用水及沖泡的茶水，研究金露梅茶對高血脂癥的影響。研究結果顯示，金露梅茶可不同程度地降低高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的總膽固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白膽固醇含量，升高高密度脂蛋白膽固醇含量，其原因可能是金露梅茶中含有的豐富的營養(yǎng)成分對機體產生的調節(jié)作用[20]，同時研究數(shù)據(jù)顯示，給予金露梅茶干預后，大鼠的厚壁菌門(Firmicutes)豐度較模型組有所減少，擬桿菌門(Bactercidetes)的豐度與模型組相比增加，與已有文獻報道，肥胖或糖尿病患者一般表現(xiàn)為Firmicutes相對豐度增加，Bacteroidetes相對豐度減少，B/ F比值降低，藥物干預后則表現(xiàn)為Firmicutes豐度減少，Bacteroidetes豐度增加結論一致[21?23]

同時本實驗數(shù)據(jù)顯示，與模型組相比，金露梅茶組乳桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）豐度增加，毛螺菌科中未分類的屬（unidentified_Lachnospiraceae）、瘤胃菌科中未分類的屬（unidentified_Ruminococcaceae）豐度降低，關于文獻報道，unidentified_Lachnospiraceae在肥胖動物腸道中具有更高的豐度，可能具有潛在的促肥胖作用[24]。Lactobacillus可通過增加抗炎因子IL-10 含量、提高肝臟GSH-Px、SOD和CAT活性，降低了MDA的活性，而減輕胰島和腺泡細胞病變情況；同時，可影響Adipoq mRNA的表達水平；而Lactobacillus豐度的增加，會影響B(tài)acteroidetes/Firmicutes的豐度比值而降低小鼠的血糖水平等機制參與糖脂代謝而產生降糖降脂的作用[25?26]。

文獻報道，擬桿菌屬(Bacteroides)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）可通過釋放膽鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)而調節(jié)甘氨酸或?；撬嵋约坝坞x膽汁酸調控脂質代謝的分子機制[26?27]，這可能也是金露梅茶具有降血脂作用的潛在機制，具體機制有待進一步的研究。

綜上，本研究表明青藏高原金露梅茶能夠調節(jié)高血脂模型大鼠表型的血脂四項指標，機制可能是其上調有益腸道菌群而抑制有害腸道菌群，使菌群的數(shù)量及比例發(fā)生變化，通過影響高血脂大鼠的脂質代謝而起到調節(jié)高脂血癥的作用。金露梅花茶、綠茶、紅茶具有調節(jié)高脂血癥大鼠血脂及腸道菌群譜的作用，使其有向正常對照組恢復的趨勢，推測金露梅茶可能經腸道菌群干預脂質代謝途徑發(fā)揮降血脂的功效，具體機制有待進一步研究。