王語聰，謝智鑫，張學(xué)艷，楊秋萍，韓建春,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150030）

在我國2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢[1]，目前糖尿病的治療方法主要包括口服抗糖尿病藥物和胰島素。然而，連續(xù)使用這些藥物會導(dǎo)致胰島素抵抗和副作用，對糖尿病患者有效、無毒和價格友好的藥物的需求迫切。近年研究表明，糖尿病特征之一就是炎性反應(yīng)，這與脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）增多有關(guān)。大量LPS進(jìn)入血液循環(huán)后誘發(fā)炎癥因子釋放，進(jìn)而引起炎癥失衡，導(dǎo)致胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）和最終誘發(fā)2 型糖尿病，現(xiàn)已證明此作用為“代謝性內(nèi)毒素血癥”[2]。腸道堿性磷酸酶（Intestinal alkaline phosphatase，IAP）可以通過對LPS進(jìn)行去磷酸化作用來保護(hù)細(xì)胞[3]，從而降低炎癥發(fā)生。此外，Bates等[4]探究LPS和IAP之間控制腸道炎癥水平的動態(tài)平衡反饋機(jī)制，研究表明LPS通過激活兩條不同的途徑誘導(dǎo)炎癥（即NFkB和LPS依賴的TNF-a釋放，后者通過TNF受體起作用）上調(diào)IAP基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，IAP使LPS去磷酸化。去磷酸化的LPS不再能夠觸發(fā)TLR4 刺激，甚至可能阻斷該受體的結(jié)合。當(dāng)刺激加大后炎癥相關(guān)基因的上調(diào)導(dǎo)致炎癥和細(xì)菌跨粘膜通道的增加，細(xì)胞內(nèi)IAP可阻止NFkB途徑的兩個關(guān)鍵蛋白磷酸化。總之，IAP通過在兩個水平下調(diào)NFkB途徑來控制炎癥：通過減少LPS對TLR4 的刺激和通過阻止NFkB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。因此，IAP與LPS呈負(fù)相關(guān)且對炎癥反應(yīng)具有控制作用。

黃芪（Astragalus）作為藥食同源植物，被廣泛應(yīng)用于臨床領(lǐng)域。黃芪屬于豆科草本植物類，含有豐富生物活性物質(zhì)[5]，如黃酮類、苷類、糖類等。研究表明，黃芪在糖尿病中主要作用是使體內(nèi)蛋白質(zhì)合成增多、減少蛋白流出和加快胰島素分泌[6]。例如，Liu等[7]研究通過提取名為AERP的新型黃芪多糖，通過對db/db糖尿病模型小鼠研究表明能夠降低體內(nèi)血糖的作用，進(jìn)而證明黃芪能夠降低糖尿病血糖。翁孝剛等[8]在研究中表明脂聯(lián)素是與胰島素敏感有一定相關(guān)性的指標(biāo)，0.1 g/L黃芪對3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素及mRNA表達(dá)水平影響最為顯著，說明黃芪對其有促進(jìn)作用，推測黃芪可以影響胰島素抵抗。此外，費煜暢等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠通過影響THP-1 衍生巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生炎癥因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-12（IL-12）和白介素-10（IL-10）]，從而調(diào)控炎癥因子表達(dá)水平，最終增強(qiáng)細(xì)胞免疫作用，抑制腫瘤生長。

上述研究已指出黃芪具有降低血壓、血糖和抗炎等活性，但黃芪作為一種藥食同源的植物，直接食用能否促進(jìn)IAP活性及在糖尿病模型中IAP、LPS和炎癥反應(yīng)三者之間的關(guān)系至今仍不清楚。因此，本實驗以T2DM大鼠為模型，通過灌胃黃芪，檢測大鼠體質(zhì)量變化和血糖濃度變化、糞便中IAP活力和LPS濃度，以及采用MSD多因子檢測手段來探究血清中炎癥因子水平[白介素-6（IL-6）、TNF-α、γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1β）、生長調(diào)節(jié)致癌基因α（KC/GRO）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-10（IL-10）、白介素-13（IL-13）]的變化，探究黃芪對糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS的變化和血清中炎癥反應(yīng)的影響，為黃芪在功能性食品開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

SPF級別SD雄性大鼠（150±20 ）g（合格證：No.1103241911038497）北京斯貝福生物有限公司；黃芪顆粒 南京同仁堂藥業(yè)采用清水煎煮，制成濃縮液，進(jìn)行灌胃用藥；鏈脲佐菌素（STZ）美國Sigma公司；堿性磷酸酶試劑盒型號P0321 碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司；內(nèi)毒素檢測試劑盒型號EC80545S廈門試劑生物科技責(zé)任有限公司；Proinflammatory Panel 2（rat）Kits型號K15059DMeso Scale Diagnostics LLC公司；AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)飼料（NMF，總熱能3601 kCal/kg，10%的能量為脂肪和14.1%的能量為蛋白質(zhì)）中國營養(yǎng)動物飼料高科技有限公司；高糖高脂飼料（1.5%膽固醇、0.25%膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、83.25%標(biāo)準(zhǔn)飼料）中國營養(yǎng)動物飼料高科技有限公司

HERAEUS Multifuge X3R離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；1300 MESO? QuickPlex SQ 120 Meso Scale Diagnostics型MULTI‐ARRAY、MULTI‐SPOT?微孔板、MSD讀板機(jī) LLC公司；I14698I血糖測定儀 強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及干預(yù) 將大鼠飼養(yǎng)于動物籠中，并保持50%±15%濕度，（22±2）℃溫度和晝夜12 h條件下單籠飼養(yǎng)。所有的試驗步驟遵循試驗動物護(hù)理以及動物協(xié)議，由西安交通大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)[10]。在適應(yīng)性喂養(yǎng)后，開始建立2 型糖尿病大鼠模型。除正常對照組外，其余組均高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 周。將模型組和黃芪劑量組給予30 mg/kg STZ腹腔注射（禁食12 h），繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料；注射后第3 d和第7 d（禁食12 h），檢測空腹血糖值，選取空腹血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠為造模成功的大鼠[11?12]。在對STZ粉劑進(jìn)行計算時，以30 mg/kg為計量標(biāo)準(zhǔn)，溶解于新鮮的檸檬酸鈉緩沖液中（0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH4.3）。為保證其特性，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并避光保存。

將大鼠分成4 組（n=10）并投喂標(biāo)準(zhǔn)飲食及高糖高脂飼料。第1 組正常對照組：未經(jīng)處理，每日給予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂并灌胃20 mL/kg超純水；第2 組模型組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并灌胃20 mL/kg超純水；第3 組黃芪低劑量組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并每天灌胃20 mL/kg黃芪劑量為0.25 g/kg溶劑；第4 組黃芪高劑量組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并每天灌胃20 mL/kg黃芪劑量為0.5 g/kg溶劑。依據(jù)文獻(xiàn)報道[13]，選擇此黃芪低、高劑量。試驗期間小鼠自由采食和飲水，每天早上八點定時灌胃，在建模成功后第4 周處死并進(jìn)行炎癥因子指標(biāo)檢測。

試驗開始后采取2 粒大鼠糞便于EP管中放在?20 ℃儲存。用于檢測糞便中堿性磷酸酶和細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

1.2.3 大鼠體重和血糖值檢測 開始條件喂養(yǎng)后，每周進(jìn)行尾靜脈采血用血糖儀測定空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG），并稱量體重。

1.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖LPS）測定 取少量糞便，加入一定比例細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗用水（1:10 g/mL），迅速離心1 min（3000×g）收集上清液，利用試管定量顯色基質(zhì)法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素濃度[14]。

1.2.5 堿性磷酸酶測定 取少量新鮮糞便，以1 mg糞便中加入50 μL PBS溶液比例進(jìn)行稀釋。用旋渦法制備糞便勻漿懸液，通過離心（20 min，10000×g）收集含IAP上清液，并根據(jù)堿性磷酸酶試劑盒說明書測定IAP活性。

1.2.6 MSD多因子檢測 炎癥因子含量利用MSD電化學(xué)發(fā)光（ECLA）檢測技術(shù)，以SULFO‐TAGTM標(biāo)記物，在MULTI‐ARRAY和MULTI‐SPOT?微孔板電極表面通電后，電化學(xué)作用激發(fā)SULFO‐TAGTM標(biāo)記物發(fā)出強(qiáng)光，檢測炎癥因子含量[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究通過Excel、Origin 2017、IBM SPSS Statistics 20 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。試驗數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM），采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即差異顯著，P<0.01 即極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠血糖變化

如表1 所示，建模前血糖無顯著差異（P>0.05），建模成功后的7 和14 d時，與正常對照組相比，模型組血糖有極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組均無顯著差異（P>0.05）。在21 d時，與正常對照組相比，模型組有極顯著差異（P<0.01）；與模型組相比，黃芪低劑量組無顯著差異（P>0.05），高劑量組顯著降低（P<0.05）。在28 d時，與正常對照組相比，模型組極顯著上升（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組均顯著降低（P<0.05）。

表1 黃芪對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（,n=10）Table 1 Effect of Astragalus powder on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats (,n=10)

表1 黃芪對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（,n=10）Table 1 Effect of Astragalus powder on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats (,n=10)

注：*表示與正常對照組相比，差異顯著P<0.05；**表示與正常對照組相比，差異極顯著P<0.01；#表示與模型對照組相比，差異顯著P<0.05：##表示與模型對照組相比，差異極顯著P<0.01；表2，圖2～圖4同。

血糖是診斷T2DM最重要標(biāo)準(zhǔn)，血糖高低標(biāo)志著T2DM病情改善情況。有研究表明，黃芪主要通過加強(qiáng)胰島素敏感性，并改善IR狀況方式降低血糖，其中黃芪中多種活性成分包括多糖、甲苷等有降糖作用[16]。本實驗研究結(jié)果表明，黃芪使T2DM大鼠降糖效果明顯，與模型組相比差異顯著（P<0.05）。說明黃芪對T2DM大鼠有輔助降糖作用，高劑量組降糖效果更好，原因可能是黃芪中活性物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)中羥基和氨基能夠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物對STZ致高血糖小鼠模型有降糖作用[17]，因而能夠有效抑制T2DM。

2.2 大鼠體質(zhì)量變化

如圖1 所示，建模完成后第4 周，與正常對照組相比，模型組體質(zhì)量顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，黃芪劑量組差異不顯著（P>0.05）。

Sensory evaluation of foreign high-end branded creams 7 20

圖1 各組大鼠體質(zhì)量隨干預(yù)時間變化（,n=10）Fig.1 Changes in body mass of rats in each group with intervention time（,n=10）

整個實驗過程中，正常對照組活動正常，精神狀態(tài)良好，色澤光亮；模型組不活潑、精神狀態(tài)差，被毛無光澤。黃芪組精神好轉(zhuǎn)，反應(yīng)敏感度加大，頹廢狀態(tài)有所改善，活動增多，說明黃芪可以緩解T2DM帶給大鼠的不良影響。結(jié)果表明，建模成功后，正常對照組體重有所增加，而模型組和黃芪劑量組喂飼高糖高脂飼料后，體重出現(xiàn)下降趨勢，原因可能是高劑量STZ與高熱量飲食聯(lián)合[18]，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生壞死，并致胰島素分泌發(fā)生不足，進(jìn)而使體內(nèi)糖代謝絮亂，發(fā)生胰島素抵抗，大鼠為體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)提供能量[19]。

2.3 糞便中IAP活性和LPS濃度變化

如表2 所示，與正常對照組相比，模型組LPS濃度顯著上升（P<0.05）；與模型組相比，黃芪劑量組LPS顯著降低（P<0.05）。在IAP方面，與正常對照組比，模型組極顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組均極顯著升高（P<0.01）。

表2 黃芪對2 型糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS影響（,n=10）Table 2 Effect of Astragalus on IAP and LPS in fecal of type 2 diabetic rats（,n=10）

表2 黃芪對2 型糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS影響（,n=10）Table 2 Effect of Astragalus on IAP and LPS in fecal of type 2 diabetic rats（,n=10）

IAP是一種腸道刷狀邊界酶，其僅在近端小腸絨毛相關(guān)腸細(xì)胞中表達(dá)，可以作為腸道粘膜防御因子，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保護(hù)宿主免受腸道炎癥損傷。IAP可以降解LPS，降低其毒性，其原因為IAP使LPS脫磷酸，失去破壞性，從而解毒[20]。有研究表明正常人糞便IAP活性要比T2DM患者活性高，糞便中IAP每降低25 μ/g，糖尿病風(fēng)險增加35%[21]。LPS是革蘭氏陰性菌的組成部分，當(dāng)腸道中LPS濃度過高時，誘發(fā)腸道炎癥發(fā)生。有證據(jù)表明，T2DM有利于內(nèi)毒素（特別是脂多糖（LPS））在腸屏障中易位，導(dǎo)致血液中內(nèi)毒素濃度輕微升高[22]。Poelstra等[23]首次發(fā)現(xiàn)LPS是IAP的作用底物，因此提出IAP可以降解LPS的假說。Bates等[24]研究結(jié)果表明，腸道中IAP和LPS存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，當(dāng)腸腔中IAP濃度增加時，對LPS作用增加，LPS所帶毒性就得到減少，降低腸道炎癥。實驗結(jié)果表明，黃芪增加T2DM大鼠糞便IAP活性和降低LPS濃度。說明黃芪能夠改善糖尿病大鼠腸道中IAP活性并降低LPS的濃度。

2.4 血清中炎癥因子含量測定

2.4.1 促炎因子含量變化 如圖2 所示，與正常對照組相比，模型組IL-6 濃度、IL-1β濃度、TNF-α濃度和IFN-γ濃度均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α和IFNγ均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。

圖2 黃芪對小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 濃度（,n=10）Fig.2 Effect of Astragalus on the concentration of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mouse serum（,n=10）

T2DM主要體現(xiàn)胰島素抵抗及胰島素分泌不足，已有研究表明，腸道慢性炎癥在T2DM發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，腸道粘膜免疫發(fā)生絮亂，就會引起腸道炎癥發(fā)生[25]。IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ可以作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在炎癥中發(fā)揮中心作用，當(dāng)免疫因子被激活時釋放，機(jī)體中其含量增加，引起損傷。有研究表明T2DM高血糖可以促進(jìn)TNFα濃度升高，過多加速胰島細(xì)胞破壞；高脂喂養(yǎng)的小鼠中腸道中IL-6 分泌增加，TNF-α表達(dá)升高[26]。張晶[27]在探討B(tài)MDM細(xì)胞中黃芪對其中炎癥因子影響中，通過黃芪誘導(dǎo)，細(xì)胞中IL-6、TNF-α表達(dá)受到抑制。鄭洋等[28]在急性胰腺炎大鼠中，經(jīng)過黃芪注射液治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道屏障功能得到保護(hù)，炎癥因子IL-6、TNF-α分泌降低；朱麗坤[29]在db/db小鼠腎臟炎癥因子中，同樣發(fā)現(xiàn)黃芪對IL-1β、TNFα起到了抑制作用。本試驗結(jié)果表示，黃芪劑量組能夠顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ濃度（P<0.05），其可能原因為促炎因子受到胰島素抵抗以后分泌速度加快，導(dǎo)致胰島素細(xì)胞凋亡速度加快，因此能夠證明，黃芪可降低相關(guān)炎癥因子濃度，從而緩解炎癥，進(jìn)而緩解T2DM。

2.4.2 抗炎因子含量變化 如圖3 所示，與正常對照組相比，模型組IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 均顯著下降（P<0.05 或P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。

圖3 黃芪對小鼠血清IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 濃度（,n=10）Fig.3 Effect of Astragalus on the concentration of IL-4,IL-5,IL-10 and IL-13 in mouse serum（,n=10）

IL-4 典型抗炎因子，在Th2 細(xì)胞中都具有代表性炎癥因子，可以抑制炎癥因子分泌，包括IL-6、TNF-α等，IL-5 同IL-4 一樣在Th2 細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，可以緩解由嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥效應(yīng)，Th2 細(xì)胞屬于抗炎細(xì)胞，起到重要抗炎作用，可以使Th1 介導(dǎo)炎癥受阻[30]；IL-10 是免疫調(diào)節(jié)因子，可以終止炎癥發(fā)生；IL-10 屬于抗炎因子，可以控制炎性反應(yīng)發(fā)生，機(jī)體組織糖、脂肪代謝可以被IL-10 調(diào)節(jié)，起到T2DM發(fā)生預(yù)防作用。IL-13 可以使巨噬細(xì)胞活化受到抑制，減少炎癥因子分泌，可以同時抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，又可以使B細(xì)胞增殖加快及分泌抗體，起到抗炎因子作用[31]。李金萍[32]探究在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中，黃芪多糖對其血清因子影響，與模型組相比IL-4 和IL-13 升高顯著，結(jié)果表明黃芪多糖升高了IL-4 和IL-13 含量，對IL-5 影響不明顯；宋厚盼等[33]研究表明黃芪建中湯對十二指腸潰瘍大鼠中血清IL-4、IL-10 含量升高，IL-13 含量下降明顯。本次實驗結(jié)果表明，與模型組相比，黃芪高劑量組中大鼠血清IL-4、IL-5、IL-10 濃度有極顯著差異（P<0.01）；黃芪高劑量組中IL-13 濃度出現(xiàn)差異顯著（P<0.05），其可能原因是黃芪刺激抗炎因子，使其表達(dá)量增加，從而抑制促炎因子的表達(dá)量，并升高抗炎因子濃度，緩解炎癥反應(yīng)。

2.4.3 趨化因子含量變化 如圖4 表示，與正常對照組相比，模型組KC/GRO濃度極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組KC/GRO濃度均極顯著降低（P<0.01）。

圖4 黃芪對小鼠血清KC/GRO濃度（,n=10）Fig.4 Effect of Astragalus affects the serum KC/GRO concentration of mice（,n=10）

KC/GRO是趨化因子中的一種，推測其表達(dá)與細(xì)胞生長有關(guān)，與受體結(jié)合后可促進(jìn)炎癥反應(yīng)[34]?？傮w來說，由于攝入高脂肪食物會導(dǎo)致腸道中LPS的釋放，破壞腸道粘膜從而刺激炎癥因子的釋放[35]，然而，目前還沒有對趨化因子的數(shù)據(jù)支撐。因此，本實驗結(jié)果表明黃芪能夠有效降低糖尿病小鼠血清中KC/GRO，進(jìn)而降低血清中促炎因子。其可能的原因是黃芪降低LPS及炎癥因子的濃度從而減少GRO的表達(dá)，進(jìn)而有效改善T2DM。

3 結(jié)論

通過糖尿病模型大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可以維持血糖穩(wěn)定，提高腸道中IAP活力，有效降低LPS濃度。通過大鼠血清中抗炎因子、促炎因子及趨化因子水平進(jìn)一步驗證LPS可能引起的炎性反應(yīng)。全面驗證了IAP與炎癥因子的關(guān)系，因此黃芪能夠有效改善T2DM的炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)腸道中IAP活力刺激LPS濃度的變化調(diào)控來實現(xiàn)的。有研究表明，IAP活性和相應(yīng)的LPS去磷酸化能力在小鼠的糞便及腸道中存在，并且IAP在控制細(xì)菌成分引起的腸道炎癥和細(xì)菌通過腸道粘膜方面的體內(nèi)作用是互補(bǔ)的[24]，因此未來需要進(jìn)一步研究黃芪在腸道粘膜中IAP是如何調(diào)控參與改善機(jī)體炎癥，緩解T2DM的發(fā)展。