姚 飛，陳復(fù)生，郝明飛

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）

近些年來，隨著納米材料在生活中的廣泛應(yīng)用，學(xué)者們對納米纖維的研究也日益增多。靜電紡絲技術(shù)已經(jīng)逐漸成為一種簡單、高效和連續(xù)制備納米纖維的技術(shù)。與傳統(tǒng)的紡絲工藝有所不同，靜電紡絲技術(shù)在靜電紡絲的過程中，聚合物溶液或熔融體在高壓靜電場中通過靜電相互作用克服表面張力，產(chǎn)生帶電射流，進(jìn)一步拉伸、劈裂、固化或溶劑揮發(fā)，最終形成纖維[1?2]。該過程操作簡便且成本低廉，制備的納米纖維具有高孔隙率、比表面積大、均一性高以及纖維孔徑之間連通性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[3?4]，還可以將多種生物活性物質(zhì)加入到紡絲液中，使得納米纖維具有多功能性[5?6]。靜電紡絲納米纖維已經(jīng)被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，例如空氣過濾、組織工程支架、化妝品行業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域中的藥物緩釋及食品工業(yè)[7]等。

之前的研究通常利用合成聚合物進(jìn)行紡絲，隨著環(huán)境與資源的壓力日益嚴(yán)峻，越來越多的研究集中于對天然聚合物的紡絲。由于天然聚合物具有可再生和可持續(xù)的特性，從這些來源獲得的纖維同時(shí)具有生物相容性和生物降解性，這使得諸如多糖和蛋白質(zhì)之類的天然聚合物成為靜電紡絲的理想候選材料[8]。以蛋白質(zhì)[9]和多糖[10]等天然聚合物作為原料，通過電紡制備的納米纖維不僅具有納米纖維的各種性能優(yōu)勢，還有良好的安全性和降解性?；ㄉ蛛x蛋白是重要的天然蛋白，來源十分豐富，具有良好的吸水性、吸油性、乳化性、泡沫性和流變性等功能特點(diǎn)，且其可加工性、生物降解性以及生物相容性等性能都非常好[11]。PPI是一種球狀蛋白質(zhì)，蛋白分子之間的交聯(lián)度小，使得單獨(dú) PPI溶液由于黏度過低而無法進(jìn)行電紡，加入高分子聚合物以增加分子間的交聯(lián)度，提高溶液黏度，從而得到電紡纖維。聚乳酸（PLLA）已被證實(shí)是一種安全、可降解，同時(shí)具有良好的可防性與生物相容性的高分子聚合材料。茶多酚（TP）是茶葉中主要生理活性成分，占茶葉干重的20%～30%，包括花色苷類和黃酮類以及黃烷醇類等多種天然物質(zhì)。相關(guān)研究表明，茶多酚具有良好的抗氧化和抗衰老、防輻射的作用，還能夠有效的降低血脂和血糖、抑菌抑酶[12?13]，近年來到受到人們的廣泛關(guān)注。

前期已有相關(guān)學(xué)者報(bào)道了電紡花生分離蛋白—聚乳酸制備納米纖維并優(yōu)化制備工藝條件的研究。然而關(guān)于用花生分離蛋白—聚乳酸作為生物活性物質(zhì)載體或者抗菌膜材料方面的研究，鮮有報(bào)道。在本試驗(yàn)中，將茶多酚與花生分離蛋白、聚乳酸進(jìn)行混合，采用靜電紡絲研制具有抗菌效果的三元復(fù)合納米纖維膜，不僅可以豐富花生分離蛋白—聚乳酸納米纖維膜的功能，也可擴(kuò)寬花生分離蛋白、茶多酚的應(yīng)用領(lǐng)域，為負(fù)載生物活性物質(zhì)及納米抗菌膜材料的應(yīng)用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生 正陽縣三農(nóng)種業(yè)有限公司；聚乳酸（醫(yī)療級，Mw=100000）濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；茶多酚 上海源葉生物科技有限公司；石油醚（AR）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（NaCl）天津市天力化學(xué)試劑有限公司；六氟異丙醇（HFIP）

上海麥克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

6YZ-180 全自動(dòng)液壓榨油機(jī) 鞏義市天元機(jī)械有限公司；FJS-6 恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌水浴鍋 常州市頂新實(shí)驗(yàn)儀器公司；LGJ-25C冷凍干燥機(jī) 四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司；Quanta FEG 250 掃描電子顯微鏡 美國 FEI公司；Nicolet 6700 紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；Q50 熱重分析儀 美國TA公司；Rigaku MininFlex 600 X-射線衍射儀 日本島津公司；DF02 靜電紡絲機(jī) 佛山輕子精密測控技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生分離蛋白提取 冷榨花生餅（DPF，蛋白質(zhì)含量為50.12%,蛋白質(zhì)含量測定參照GB/T 5009.5-2010，轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.46）：利用液壓榨油機(jī)將花生在室溫、55 MPa的壓力下壓榨65 min，獲得冷榨花生餅；花生餅粉碎后經(jīng)石油醚脫除殘余油脂，過80 目篩得DPF。參考矯麗媛等[14]的方法并稍作調(diào)整。將DPF與蒸餾水以1:10 的料液比均勻混合，再用1 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至9.0，在50 °C下攪拌100 min后，于4000×g轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液，再利用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH至花生蛋白等電點(diǎn)，攪拌30 min，于4000×g轉(zhuǎn)速下離心20 min，下層沉淀水洗至中性，冷凍干燥后得PPI。

1.2.2 紡絲共混溶液的制備 用天平稱取適量的花生分離蛋白（PPI）和聚乳酸（PLLA），按照其兩者質(zhì)量比1:1 的比例，以六氟異丙醇（HFIP）為溶劑，配制濃度（w/v）為10%的紡絲溶液，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6%、8%、10%（相比于花生分離蛋白粉末和聚乳酸總質(zhì)量）的茶多酚（TP）加入溶液中，水浴40 ℃下磁力攪拌12 h，得到共混溶液。

1.2.3 靜電紡絲 將上述配制好的溶液倒入10 mL注射器中，之后在注射泵上安裝好注射器，進(jìn)行高壓電源和針頭的連接，調(diào)整接收滾筒與針頭間距。相關(guān)的測試參數(shù)包括:0.6 mL/h紡絲速度，電壓16 kV，針尖-接收滾筒間距為12 cm，環(huán)境的濕度為45%～50%，紡絲溫度為25 °C。最后將收集到的纖維膜至于常溫干燥箱中干燥備用。

1.2.4 納米纖維膜的形貌表征 將納米纖維樣品置于導(dǎo)電硅膠上，噴金后進(jìn)行掃描，觀察納米纖維膜的表面結(jié)構(gòu)形態(tài)。選用Image Plus Pro 6 作為SEM圖像的分析軟件。

1.2.5 傅里葉紅外光譜 將納米纖維膜樣品與KBr（質(zhì)量比為1:100）混合并壓入透明薄片中進(jìn)行FTIR測試。設(shè)置光譜分辨率為4 cm?1，掃描32 次獲取樣品在400～4000 cm?1范圍內(nèi)的傅里葉紅外光譜。

1.2.6 TGA分析 稱取10 mg樣品，利用熱重分析儀(TGA)測定TP和電紡纖維的熱性能。測試參數(shù)：氮?dú)饬髁繛?0 mL/min，測試溫度范圍為35～600 °C，升溫速率為10 °C/min。

1.2.7 接觸角測定 用接觸角測試儀測定不同含量的TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維膜，將測試樣品裁剪為（2 cm×5 cm）于試樣夾持器上，調(diào)節(jié)合適的對比度和亮度，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下進(jìn)行測試。

1.2.8 X衍射分析 通過X-射線衍射圖譜研究TP粉末、靜電紡PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維的結(jié)構(gòu)。測試條件：Cu-Kα 射線（λ=1.54056 ?），管電流：15 mA，管電壓：40 kV，掃描速度：10 °min?1，掃描角度(2θ)范圍：為10～60 °。

1.2.9 抑菌性能測試 參考費(fèi)燕娜等[13]方法并稍作調(diào)整進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。菌種活化：將1 g蛋白胨，0.3 g牛肉浸膏，0.5 g NaCl加入到100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液的 pH為7.2，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，120 min）。在無菌操作環(huán)境下將金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）分別移植到培養(yǎng)基中活化，37 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)12 h備用。在無菌培養(yǎng)皿中分別加入（S.aureus）和（E.coli）菌懸液，然后倒入冷卻至 40 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，立即旋轉(zhuǎn)使其充分均勻分散，放置5 min待培養(yǎng)基凝結(jié)后，將直徑8 mm的試樣在紫外燈光照 20 min殺菌后置于瓊脂培養(yǎng)基的中央，并輕微按壓，確保試樣和培養(yǎng)基充分接觸，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察試樣周圍的細(xì)菌生長情況，測量抑菌圈尺寸。根據(jù)抑菌圈寬度來判定抑菌效果的好壞。每個(gè)試樣至少測量3 處，取平均值。抑菌圈大小可按式（1）計(jì)算:

式中:H為抑菌圈寬度，cm；D為抑菌圈外徑的平均值，cm；d為試樣直徑，cm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05 表示樣品間存在差異性顯著，分別使用Origin 8.5 和Image Plus Pro 6 進(jìn)行作圖分析和測量纖維的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的茶多酚對花生分離蛋白—聚乳酸纖維形貌和直徑的影響

圖1 為添加不同含量茶多酚的花生分離蛋白-聚乳酸復(fù)合納米纖維的SEM圖和直徑分布圖。通過Image Plus Pro 6 測量花生分離蛋白-聚乳酸復(fù)合納米纖維膜纖維的平均直徑為（181±62）nm(見圖1（A）)。TP的加入對PPI/PLLA復(fù)合納米纖維的形態(tài)并未產(chǎn)生明顯的影響，但隨著TP含量的增加，PPI/PLLA復(fù)合納米纖維的平均直徑稍有增加，分別為（185±57）nm、（199±63）nm和（222±72）nm (見圖1B、C、D)，這可能是由于TP的加入增大了PPI/PLLA溶液的粘度。在電紡條件一定的情況下，紡絲溶液粘度的增加導(dǎo)致PPI/PLLA溶液的表面張力增加，進(jìn)一步使得電場力克服溶液表面張力的難度增大，射流不能在電場中被充分拉伸，因此，PPI/PLLA復(fù)合納米纖維的直徑增加。此外，TP也可能在PPI/PLLA納米纖維中發(fā)生團(tuán)聚，使納米纖維不能取向排列，從而使得納米纖維直徑變粗。

圖1 不同含量茶多酚的花生分離蛋白—聚乳酸納米纖維SEM圖Fig.1 SEM images of peanut protein isolate-polylactic acid nanofibers with different contents of tea polyphenols

2.2 FTIR分析

傅里葉變換紅外光譜測試技術(shù)是一種快速的檢測技術(shù)，常被應(yīng)用于對物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成的分析，也是分析靜電紡纖維組成和結(jié)構(gòu)的常用的有效方法之一。圖2 為TP、PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA（TP含量為8%）納米纖維復(fù)合膜的紅外光譜圖。從TP、PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA的紅外光譜可以看出3000～3500 cm?1處的較寬的吸收峰歸屬于NH和O-H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)[15?16]。紅外光譜圖中位于2924 cm?1和2875 cm?1處的吸收峰分別歸屬于對稱和不對稱的-CH2[17]。這可能是PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA納米纖維膜中存在PPI。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，在TP/PPI/PLLA紅外光譜1522～1446 cm?1范圍內(nèi)出現(xiàn)苯環(huán)上的骨架（C-C）振動(dòng)吸收峰，此外，在紅外光譜圖中的809 cm?1位置處出現(xiàn)了苯環(huán)上C-H彎曲振動(dòng)吸收峰，這說明了TP成功的負(fù)載到PPI/PLLA納米纖維膜中，且TP與PPI、PLLA共混之后，PPI/PLLA納米纖維膜的峰沒有消失，峰強(qiáng)度增強(qiáng)。這可能是由于加入TP的含量過多導(dǎo)致其紅外特征吸收峰的信號太高，或者可能由于TP的紅外特征吸收峰與基體材料的紅外特征吸收峰發(fā)生重疊。三種物質(zhì)在紅外光譜圖中指紋區(qū)并未產(chǎn)生新的吸收峰這說明TP與基體材料的原料未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，僅僅是物理性復(fù)合。

圖2 TP粉末、靜電紡PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA納米纖維膜的FTIR圖Fig.2 FTIR diagram of TP powder,electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA nanofiber membranes

2.3 熱重分析

熱重分析，是指在加熱的過程中，通過對被測樣品進(jìn)行質(zhì)量分析，可得到樣品質(zhì)量隨溫度變化的曲線，進(jìn)而對被測樣品發(fā)生變化（汽化、升華和分解等）時(shí)的溫度和質(zhì)量損失進(jìn)行研究。圖3 為隨著溫度的升高TP粉末、PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA納米纖維膜質(zhì)量變化情況，從圖中可知，在150 ℃之前造成的質(zhì)量損失是由于水分蒸發(fā)引起。當(dāng)溫度升至150 ℃后，TP的質(zhì)量開始明顯下降。當(dāng)溫度升至200 ℃左右時(shí)，PPI/PLLA納米纖維膜和TP/PPI/PLLA納米纖維膜質(zhì)量開始出現(xiàn)下降的趨勢。此外，TP/PPI/PLLA納米纖維膜開始分解溫度略低于PPI/PLLA納米纖維膜。加入TP/PPI/PLLA三元復(fù)合納米纖維膜先于PPI/PLLA二元復(fù)合納米纖維膜分解，說明了PPI/PLLA包埋了一定的TP，就是因?yàn)檫@一部分的TP的存在，PPI/PLLA納米纖維膜的熱穩(wěn)定性有所下降。經(jīng)PPI/PLLA納米纖維膜包埋后，TP的分解溫度明顯提高，該結(jié)果表明PPI/PLLA能夠有效提高了TP的熱穩(wěn)定性，因此PPI/PLLA作為包埋多酚等活性物質(zhì)的載體方面具有一定的應(yīng)用前景。

圖3 TP粉末、靜電紡PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維膜的TG圖Fig.3 TG diagram of TP powder,electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA composite nanofiber membranes

2.4 接觸角分析

接觸角（contact angle）是指位于固、液、氣三相交界處，自固-液界面經(jīng)過液體內(nèi)部到氣-液界面之間的夾角（θ），當(dāng)θ<90 °時(shí)表明固體表面是親水性的，即液體較易潤濕固體，因此接觸角值越小則表示樣品的親水性越好；反之，表示樣品的親水性較差，它也是衡量材料表面潤濕性能的一項(xiàng)重要參數(shù)。如圖4 所示，隨著TP的增加，接觸角呈下降趨勢，這是因?yàn)門P中含有大量的親水基團(tuán)所致，使得靜電紡復(fù)合納米纖維的親水性得到改善，但總體還是呈現(xiàn)出疏水性，這是可能是因?yàn)榧尤氲腡P沒有和載體材料發(fā)生反應(yīng)，結(jié)構(gòu)沒有被破壞。

圖4 不同含量TP的PPI/PLLA納米纖維膜靜態(tài)接觸角Fig.4 Static contact angle of PPI/PLLA nanofiber membrane with different content of TP

2.5 X衍射分析

X射線衍射技術(shù)在纖維材料領(lǐng)域的應(yīng)用主要應(yīng)用體現(xiàn)三個(gè)方面[19]，分別為鑒別纖維的種類，測定纖維的取向度及結(jié)晶度。靜電紡纖維一種新型納米材料同樣可以利用X射線衍射進(jìn)行結(jié)晶及取向等問題研究。圖5 為TP粉末、靜電紡PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維膜X-射線衍射譜圖。由圖5 可以看出，TP、靜電紡PPI/PLLA納米纖維膜以及TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維膜的X射線衍射譜圖中僅出現(xiàn)一個(gè)較寬的彌散衍射峰，分別位于衍射角21 °、20 °和19 °附近。隨著TP的加入，PPI/PLLA納米纖維膜的衍射峰的逐漸變窄，且強(qiáng)度增強(qiáng)，并向左產(chǎn)生輕微的移動(dòng)，偏移2 °，表明了小分子TP的加入改變了兩者相互作用的方式，在一定程度上改變了PPI/PLLA納米纖維膜的晶體結(jié)構(gòu)，此外也說明了TP成功地負(fù)載在PPI/PLLA納米纖維膜里。這可能是因?yàn)楹蠵PI、PLLA、TP的三元紡絲溶液中，TP加入改變了原溶液性質(zhì)，且產(chǎn)生了靜電相互作用，導(dǎo)致衍射峰的峰型發(fā)生變化。

圖5 TP粉末、靜電紡PPI/PLLA和TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維膜的X-射線衍射譜圖Fig.5 X-ray diffraction spectrum of TP powder,electrospun PPI/PLLA and TP/PPI/PLLA composite nanofiber membranes

2.6 抑菌性能分析

圖6 為不同TP含量的PPI/PLLA納米纖維薄膜對金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸桿菌（E.coli）的抑菌圈實(shí)驗(yàn)效果圖。由圖6 可以看出，沒有TP加入的PPI/PLLA納米纖維膜沒有抑菌圈，加入TP的PPI/PLLA納米纖維膜，使得S.aureus和E.coli的生長受到抑制，其原因是：茶多酚抑制S.aureus和E.coli生長的作用位點(diǎn)是細(xì)胞膜，基于TP分子中的多酚羥基與蛋白質(zhì)分子中的羧基或者氨基發(fā)生反應(yīng)，形成氫鍵絡(luò)合，從而破壞細(xì)胞膜的通透性。另外，茶多酚的加入充當(dāng)了競爭者的角色，使得S.aureus和E.coli的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程受到影響，進(jìn)而對其生長產(chǎn)生一定長度的抑制。如表1 所示，隨著TP含量的增多，抑菌圈的寬度也是不斷變大，抗菌作用增強(qiáng)，這可能是由于TP含量的增加加快了其擴(kuò)散速度。當(dāng)TP含量大于8%時(shí)，抗菌效果不再明顯增加，這是由于TP不僅作為抗菌劑，還能在PLLA的輔助下電紡成絲，分布在纖維表面及內(nèi)部。從圖中還可以看出TP對S.aureus的抗菌能力高于E.coli，與較多文獻(xiàn)結(jié)果一致[20]，這是由于E.coli表面具有保護(hù)層，外膜中的多糖與多酚羥基發(fā)生反應(yīng)，從而減少對細(xì)胞膜的破壞程度，因此，TP/PPI/PLLA復(fù)合納米纖維薄膜對S.aureus抗菌效果優(yōu)于E.coli。

表1 不同含量TP的PPI/PLLA納米纖維膜的抑菌圈直徑（cm）Table 1 Antibacterial width of PPI/PLLA nanofiber membrane with different content of TP (cm)

圖6 不同含量TP的PPI/PLLA納米纖維膜的抑菌效果Fig.6 Antibacterial effects of PPI/PLLA nanofiber membranes with different contents of TP

3 結(jié)論

采用靜電紡絲技術(shù)，以茶多酚為模型生物活性物質(zhì)，以PPI/PLLA為載體，制備出含有TP的PPI/PLLA復(fù)合納米纖維薄膜，并對TP/PPI/PLLA納米纖維膜進(jìn)行表征和抑菌研究。結(jié)果表明：TP的加入對PPI/PLLA復(fù)合納米纖維的形態(tài)并未產(chǎn)生明顯的影響，但隨著TP含量的增加，PPI/PLLA復(fù)合納米纖維的平均直徑呈現(xiàn)增加的趨勢，分別為（185±57）nm、（199±63）nm和（222±72）nm。TP、PPI和PLLA三者相互作用的方式可能是通過靜電相互作用和氫鍵作用。TP/PPI/PLLA不僅具有良好的疏水性和熱穩(wěn)定性，還具有良好的抑菌效果，尤其是金黃色葡萄球菌。