許 磊，張文昌，趙 巖，張勁松

（中國科學(xué)院金屬研究所，沈陽材料科學(xué)國家研究中心，遼寧沈陽 110016）

甲殼素（Chitin）由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4 糖苷鍵聚合而成，是自然界第二豐富的有機(jī)天然多糖，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動(dòng)物以及蘑菇等菌類的細(xì)胞壁中[1]。甲殼素及其衍生物具有無毒性、生物相容性和生物可降解性等多種優(yōu)良性能，在食品、生物醫(yī)藥、材料、農(nóng)業(yè)、紡織印染等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[2?5]。由于甲殼素具有高度有序的晶體結(jié)構(gòu)和大量的分子間和分子內(nèi)氫鍵，難溶于水和常見的有機(jī)溶劑，其應(yīng)用受到了很大的限制[6]。殼聚糖（Chitosan）是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，是甲殼素最重要的衍生物之一，可溶解于部分稀酸中，其應(yīng)用比甲殼素更為廣泛[7?8]。殼聚糖的脫乙酰度（Degree of Deacetylation，DD）直接影響其溶解度、粘度、離子交換能力和絮凝性等性能，是評(píng)價(jià)殼聚糖質(zhì)量的重要技術(shù)指標(biāo)之一。高脫乙酰度（DD>90%）的殼聚糖不僅溶解和離子交換性能良好，還具有更優(yōu)良的抑菌性[9?10]和生物相容性[11]，主要應(yīng)用于可食用膜[12?13]和生物醫(yī)用材料[14?15]等領(lǐng)域，因此高脫乙酰度殼聚糖具有更高的商業(yè)價(jià)值。目前殼聚糖主要通過甲殼素非均相脫乙酰反應(yīng)制備。影響殼聚糖脫乙酰度的參數(shù)主要包括反應(yīng)溫度、NaOH濃度和堿處理方式（處理次數(shù)）等[16]。通常為了獲得高脫乙酰的殼聚糖，需要采用堿多次處理的方式[17?18]，其制備工藝更為復(fù)雜。

超微粉碎（Superfine grinding）技術(shù)利用機(jī)械或流體動(dòng)力的方法克服物料內(nèi)部凝聚力使之破碎，將粒徑3 mm以上的物料粉碎至100 μm以下，廣泛應(yīng)用于食品[19?21]、化工[22]、醫(yī)藥[23?24]等領(lǐng)域，超微粉碎制備的超細(xì)粉具有良好的溶解性、分散性、化學(xué)反應(yīng)活性等特殊性能[25]。甲殼素經(jīng)超微粉碎處理后，其粒度和結(jié)晶度均明顯降低[26]。本研究以超微粉碎處理得到的甲殼素細(xì)粉為原料，非均相脫乙酰制備殼聚糖，利用超微粉碎細(xì)粉良好的化學(xué)反應(yīng)活性，提高甲殼素非均相脫乙酰反應(yīng)的效率，減少反應(yīng)過程中堿的用量（減少排放）和簡化高脫乙酰度殼聚糖的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-甲殼素 大連中科格萊克生物科技有限公司，來源于阿拉斯加雪蟹（粘均分子量Mv=535 kDa，脫乙酰度DD=8.32%）；其他試劑 均為AR級(jí)。

ZNC-300X碾磨式超微粉碎機(jī) 中科耐馳技術(shù)（北京）有限公司；Bettersize2600 激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司；D/max-2500PC X射線衍射儀 日本理學(xué)電機(jī)（RIGAKU）株式會(huì)社；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甲殼素的超微粉碎 先將甲殼素用普通粉碎機(jī)進(jìn)行粗粉碎，過篩得到60 目甲殼素（命名為cht-0）。然后取400 g cht-0 置于碾磨式超微粉碎機(jī)的碾磨腔中進(jìn)行超微粉碎。超微粉碎機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為40 r/min，電流設(shè)置為2.5 A，每隔15 min，收集適量樣品，用于后續(xù)的測(cè)試和脫乙酰反應(yīng)研究。根據(jù)碾磨時(shí)間（15、30、45 和60 min）的不同，總共收集得到4 種甲殼素細(xì)粉，依次命名為cht-1、cht-2、cht-3 和cht-4。

1.2.2 甲殼素細(xì)粉的XRD（X射線衍射）和粒徑分析

甲殼素細(xì)粉（cht-1～cht-4）和60 目甲殼素（cht-0）的XRD采用X射線衍射儀測(cè)定。衍射條件為Cu Kα輻射源（λ=0.1542 nm），采用石墨單色器對(duì)射線束進(jìn)行單色化，管電壓為50 kV，管電流200 mA，掃描步長為0.02 °，掃描范圍5～60 °。甲殼素樣品的結(jié)晶度按照Ioelovich[27]的方法計(jì)算。

甲殼素細(xì)粉（cht-4）的粒徑使用激光粒度分布儀測(cè)定。將2 mg樣品放入30 mL蒸餾水中，超聲充分分散，然后逐滴加入至充滿蒸餾水的樣品池中。通過控制折光率來調(diào)節(jié)加入的樣品量，折光率控制在10%～13%，循環(huán)水的循環(huán)速度為600 r/min。

1.2.3 甲殼素非均相脫乙酰反應(yīng)制備殼聚糖及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 參考Chang等[28]的方法，具體如下：分別取上述得到的甲殼素粉末（cht-0～cht-4）5 g，放置于100 mL圓底燒瓶中，然后加入50 mL 40wt%的NaOH溶液（甲殼素粉末和NaOH溶液的料液比為1:10），待甲殼素分散均勻后置于一定溫度（90、95 和100 ℃）的油浴鍋中，進(jìn)行非均相脫乙酰反應(yīng)。在反應(yīng)時(shí)間為1、2、3 和4 h取出適量的反應(yīng)物，立即倒入裝有200 mL蒸餾水的燒杯中，使脫乙酰反應(yīng)停止。反應(yīng)物用布氏漏斗抽濾，固體部分先用蒸餾水洗滌3 次，再用無水乙醇洗滌2 次，最后60 ℃烘干，得到殼聚糖。

1.2.4 殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定 采用雙突躍電位滴定法[29]測(cè)定殼聚糖的脫乙酰度，計(jì)算公式如下：

其中：G：殼聚糖樣品（130 ℃充分干燥）的質(zhì)量（g）；C：NaOH的濃度（mol/L）；V1：第一突躍點(diǎn)時(shí)用去的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；V2：第二突躍點(diǎn)時(shí)用去的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；203：N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的相對(duì)分子質(zhì)量；42：乙酰基的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎甲殼素的制備和分析

采用XRD分析了甲殼素粉末（cht-0～cht-4）的結(jié)晶行為，其譜圖見圖1。由圖1 可知，隨著超微粉碎處理時(shí)間的增加，甲殼素在9.2 °處的（020）面和19.2 °處的（110）面的兩個(gè)特征尖峰的強(qiáng)度逐漸降低，說明其微觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞[30]。甲殼素粉末cht-0 的結(jié)晶度經(jīng)計(jì)算為96.14%，隨著超微粉碎處理，甲殼素的結(jié)晶度逐漸降低，最后得到的甲殼素細(xì)粉cht-4 的結(jié)晶度僅為8.09%，接近于完全非晶化的甲殼素。結(jié)晶度降低的原因是碾磨削弱了甲殼素的氫鍵網(wǎng)絡(luò)[31]。

圖1 甲殼素粉末（cht-0～cht-4）的XRD譜圖Fig.1 XRD pattern of chitin samples (cht-0～cht-4)

采用激光粒度分布儀分析甲殼素細(xì)粉cht-4 的粒徑分布，其粒徑分布圖見圖2（其中累積分布表示小于某顆粒粒徑的百分含量；區(qū)間分布表示粒徑區(qū)間中某顆粒的百分含量）。甲殼素細(xì)粉cht-4 的體積平均徑為41.44 μm，小于60 目甲殼素cht-0 粒徑（250 μm）的五分之一，90%的粒徑低于96.33 μm，已達(dá)到超微粉碎的級(jí)別。

圖2 甲殼素樣品cht-4 的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution pattern of chitin sample cht-4

2.2 甲殼素非均相脫乙酰制備殼聚糖

不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間得到殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度見表1。由表1 可知，隨著甲殼素樣品結(jié)晶度的降低，在相同的反應(yīng)條件下（反應(yīng)溫度和時(shí)間），其制備的殼聚糖的脫乙酰度更高。其中非晶化程度高的甲殼素細(xì)粉cht-3 和cht-4，經(jīng)單次堿處理即可得到脫乙酰度90%以上的殼聚糖，可以大幅降低整個(gè)脫乙酰過程中堿的用量，簡化生產(chǎn)工藝。

表1 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間得到殼聚糖的脫乙酰度（%）Table 1 Degree of deacetylation of chitosan obtained at different reaction temperature and time（%）

2.3 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析

甲殼素的非均相脫乙酰反應(yīng)是與NaOH和乙酰氨基的濃度相關(guān)的二級(jí)反應(yīng)，但由于NaOH是遠(yuǎn)過量的，通常認(rèn)為甲殼素的脫乙酰反應(yīng)為準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)[32]（只與乙酰氨基的濃度相關(guān)），速率常數(shù)與脫乙酰度的關(guān)系可以表示為：

式中：DD為反應(yīng)產(chǎn)物的脫乙酰度（%）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；k為反應(yīng)速率常數(shù)（min?1）。

分別對(duì)不同結(jié)晶度的甲殼素在90、95 和100 ℃反應(yīng)溫度下的脫乙酰產(chǎn)物的?ln(1?DD)對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作圖，得到圖3，圖中直線的斜率即為甲殼素的脫乙酰反應(yīng)速率，表觀一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)見表2。

表2 甲殼素脫乙酰反應(yīng)的表觀一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)Table 2 Apparent first order rate constants of deacetylation of chitin

圖3 甲殼素（cht-0～cht-4）在不同反應(yīng)溫度下?ln（1?DD）隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.3 Variation of -ln (1-DD) with reaction time for chitin(cht-0～cht-4) at different reaction temperatures

根據(jù)阿倫尼烏斯（Arrhenius）公式計(jì)算甲殼素的脫乙?；罨埽?/p>

式中，k為反應(yīng)速率常數(shù)；Ea為反應(yīng)活化能（J/mol）；R為通用氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；T為熱力學(xué)溫度（K）。

分別對(duì)不同結(jié)晶度的甲殼素的ln k對(duì)-1/RT作圖，即可求得反應(yīng)的活化能。如圖4 所示，甲殼素（cht-0～cht-4）對(duì)應(yīng)的脫乙酰反應(yīng)活化能分別為58.17、47.23、42.30、35.44 和31.73 kJ/mol，表明隨著甲殼素樣品結(jié)晶度的降低，其非均相脫乙酰的反應(yīng)活性增強(qiáng)。

圖4 甲殼素（cht-0～cht-4）的脫乙酰反應(yīng)ln k隨-1/RT的變化Fig.4 Variation of ln k in the deacetylation reaction of chitin (cht-0～cht-4) with -1/RT

2.4 非晶化對(duì)甲殼素非均相脫乙酰反應(yīng)的影響分析

根據(jù)文獻(xiàn)[28,33?34]報(bào)道，甲殼素分子鏈表面的NaOH的濃度是影響脫乙酰效率的主要因素（甲殼素脫乙酰反應(yīng)歷程如圖5 所示，其中第（1）步反應(yīng)是可逆過程，需要克服一定的活化能，是整個(gè)反應(yīng)的控速步驟[35]）。隨著脫乙酰反應(yīng)的進(jìn)行，NaOH能與低分子電解質(zhì)（脫乙酰產(chǎn)物）以及多糖分子會(huì)形成溶劑化結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甲殼素分子鏈表面NaOH的濃度降低，脫乙酰反應(yīng)難以繼續(xù)進(jìn)行[36]。因此，即使提高NaOH的濃度和反應(yīng)溫度，也很難直接得到高脫乙酰度殼聚糖。通常需要多次堿處理減少低分子電解質(zhì)的含量和溶劑化結(jié)構(gòu)，來實(shí)現(xiàn)高脫乙酰度殼聚糖的制備[17?18]。

圖5 甲殼素非均相脫乙酰反應(yīng)歷程Fig.5 Heterogeneous deacetylation process of chitin

甲殼素經(jīng)超微粉碎非晶化處理后，結(jié)晶度的降低提高了反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散速度，有利于乙?；拿撀浜偷头肿与娊赓|(zhì)向溶劑中運(yùn)輸，減少反應(yīng)過程中形成的溶劑化結(jié)構(gòu)，減緩甲殼素分子鏈表面NaOH的濃度降低速率，從而提高脫乙酰反應(yīng)的效率（降低反應(yīng)活化能）。非晶化程度高的甲殼素樣品（cht-3、cht-4）經(jīng)單次堿處理，即可得到高脫乙酰度（DD>90%）殼聚糖。

3 結(jié)論

高脫乙酰度殼聚糖通常需要采用甲殼素經(jīng)多次堿處理的工藝制備。本研究提供了一種通過超微粉碎處理甲殼素，使其非晶化后再脫乙酰制備殼聚糖的技術(shù)路線。非晶化程度高的甲殼素，經(jīng)過單次堿處理即可得到高脫乙酰度（DD>90%）殼聚糖，可以大幅降低脫乙酰反應(yīng)過程中堿的用量，簡化生產(chǎn)工藝，具有良好的應(yīng)用前景。