馬金虎，侯娟，何洪，李益燦，黃春瀅，孫雯婷

（湖南吉首大學(xué)，湖南吉首416000）

經(jīng)過查閱大量文獻(xiàn)，我們對湘西土家藥冬古子中總皂苷類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及體外抑菌活性研究的方法有了一些大致的了解?？傇碥帐擒赵獮槿苹蚵菪尥轭惖囊活愝^復(fù)雜的糖苷類化合物，廣泛存在于中草藥中[1]。本項提取方法快速、有效，研究方法簡便、及時、可靠，優(yōu)化改良提取方法，為冬古子果實的綜合利用提供理論支持，從天然植物藥材中提取純化物質(zhì)總皂苷，其醫(yī)藥、保健功能有效且毒副作用與人工合成品相比較小,發(fā)展前景廣闊具有帶動當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)及醫(yī)藥保健行業(yè)發(fā)展效應(yīng)。土家藥冬古子果實的本草學(xué)研究雖有一定成果，但對其活性成分的抑菌效果以及比較方面缺乏深入研究，故未形成冬古子果實在抑菌醫(yī)藥方面的研究價值和可靠的理論支持，利用湘西具有得天獨厚的野生藥冬古子資源，采用冷凝回流提取法，乙醇提取法（采用濃度、時間、溫度梯度、料液比）、丙酮提取法來提取冬古子果實中的總皂苷來研究工藝優(yōu)化及體外抑菌活性，完成本次課題。本項以土家族藥材冬古子果實提取總皂苷為研究對象，采用乙醇提取法來提取冬古子果實中總皂苷的有效活性物質(zhì)；并使用正交試驗設(shè)計，響應(yīng)面法優(yōu)化冬古子果實提取方案；為冬古子果實的綜合利用提供理論支持，促進(jìn)抑菌藥物的研究發(fā)展，為今后抑菌類有效活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供有價值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥

購買土家藥冬古子，經(jīng)鑒定和《中國藥典》冬古子藥材向下規(guī)定相符[2]。

1.2 儀器

采用天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)的高速萬能粉碎機(jī)，上海黃海藥檢儀器有限公司生產(chǎn)的電熱恒溫水浴鍋，保定高新區(qū)陽光科教儀器廠生產(chǎn)的紫外分光光度計（UV751GD）、數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE型）、循環(huán)水式多用真空泵（SHD-Ⅲ型），上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2型），日本島津公司生產(chǎn)的液相色譜儀（LC-10Atvp型）。

1.3 方法

1）冬古子中總皂苷的提取。將新鮮冬古子樣品洗凈，切斷，于40～60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎并過50目篩，密封保存?zhèn)溆?。稱取一定量的冬古子粉末，研究不同提取時間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度等試驗條件對冬古子總皂苷提取率的影響。精密稱取一定質(zhì)量的冬古子粉末，置于圓底燒瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，在一定的水浴條件下進(jìn)行回流提取，離心過濾。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，干燥至恒重。提取率計算公式如下：提取率/%=冬古子粗提物中總皂苷重量/冬古子原料總重量×100。

2）響應(yīng)面法優(yōu)化冬古子中皂苷提取工藝。根據(jù)Design-Expert8.0中Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比4個因素分別以A、B、C、D表示，每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值。試驗因素及水平編碼見表1。

表1 試驗因素及水平編碼

3）冬古子中總皂苷物質(zhì)的提取——乙醇提取法。①乙醇濃度對總皂苷提取率的影響。取冬古子果實粉末1 g，分別加入不同濃度的乙醇溶液55%、75%、95%，液料比為20∶1（g/mL），超聲提取時間3 min，按2.1步驟測定吸光度，每組做3個平行試驗；②提取時間對總皂苷提取率的影響。取冬古子果實粉末1 g，分別提取15、25、35min，以75%濃度乙醇為提取劑，液料比為20∶1（mL/g）。按2.1步驟測定吸光度，每組做3個平行試驗；③提取溫度對總皂苷提取率的影響。取冬古子果實粉末1 g，分別提取20、40、60℃，以75%濃度乙醇為提取劑，液料比為20∶1（mL/g）。按2.1步驟測定吸光度，每組做3個平行試驗；④液料比對總皂苷提取率的影響。取冬古子果實粉末1 g，分別用不同的液料比10∶1、20∶1、30∶1（mL/g），以75%濃度乙醇為提取劑，用超聲提取35 min。按2.1步驟測定吸光度，每組做3個平行試驗。

4）生長曲線的測定。選取抑菌實驗效果最明顯的菌種作為供試菌，研究抑菌效果最顯著的提取物對該菌生長的影響，生長曲線的測定參考王巍[3]的方法并略作修改。

5）冬古子總皂苷提取液抑菌效果測定。采用無菌藥敏試紙擴(kuò)散法，通過抑菌環(huán)的直徑大小來判斷冬古子總皂苷提取液對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌4種菌的是否有抑菌效果，并且判斷對這四種菌的抑制強弱。通過正交實驗及工業(yè)優(yōu)化得出最佳提取條件，然后在這一提取條件下的同一濃度對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌4種菌的抑菌效果進(jìn)行評定，取出對哪種抑菌效果最好。具體操作為：

①藥敏試紙的制備：在無菌條件下，將無菌藥敏試紙分別浸泡在3.125mg/mL總皂苷提取液和無菌水中15min，然后用無菌鑷子將浸泡好的藥敏試紙放置在盤中備用。

②培養(yǎng)基的制備：無菌條件下，用15cm培養(yǎng)皿，平均劃分四個區(qū)域并在固定的位置做好相應(yīng)的編號A～D，

將普通營養(yǎng)在45～55℃倒入無菌培養(yǎng)皿當(dāng)中，等到其凝固之后在四個區(qū)域分別接入金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌4種菌，將已制備好的藥敏試紙分別放入培養(yǎng)基的四個區(qū)域中，每種菌三份，同時設(shè)置空白對照，然后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。最后對抑菌環(huán)直徑測量三次，取平均值作為實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

1）乙醇濃度對冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱取出來，將提取溫度、料液比設(shè)定為60℃、1∶20（g/mL），分別用55%、75%、95%的乙醇提取35min，結(jié)果表明，溶劑最好為55%乙醇。

2）料液比對冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱取出來，將提取溫度、乙醇濃度分別設(shè)定為60℃、75%，分別以蘆筍粉末質(zhì)量：乙醇溶液體積1∶10、1∶20、1∶30（g/mL）的料液比提取35min，結(jié)果表明，料液比最好為1∶20。

3）提取溫度對冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱取出來，將料液比、乙醇濃度分別設(shè)定為1∶20（g/mL）、75%，分別在20℃、40℃、60℃溫度下提取35min，結(jié)果表明，提取溫度最好為60℃。

4）提取時間對冬古子總皂苷提取率的影響。將冬古子粉末稱取出來，將溫度、料液比、乙醇濃度分別設(shè)定為60℃、1∶20（g/mL）、75%，分別提取15min、25min、35min，結(jié)果表明，提取時間最好為35min。

2.2 正交實驗

為研究四個因素對冬古子總皂苷的提取率的影響特安排四因素三水平的正交實驗，試驗因素與水平見表2和表3。結(jié)果分析:方差分析選出最佳提取方案，實驗1、2、3、4、5、6、7、8、9的MIC值分 別 為 12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。因此實驗3為最佳提取方案。

表2 試驗因素與水平

表3 實驗計劃表

2.3 冬古子總皂苷提取液對四種致病菌抑菌效果

通過比較抑菌環(huán)得出：3.125mg/mL的冬古子總皂苷提液對四種菌均有抑菌環(huán)的出現(xiàn)，并且抑菌環(huán)明顯，通過對抑菌環(huán)直徑大小測量結(jié)果可知：冬古子總皂苷提取液對大腸桿菌的抑菌抑菌效果最為明顯。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)今社會對抑菌類藥物需求量大，發(fā)掘土家藥冬古子提取物新活性,拓寬其應(yīng)用范圍。冬古子別名為瓜蔞，栝樓屬Trichosanthes L，生于向陽山坡林下、灌叢中、草地和村旁田邊。在秋冬時取材于成熟的果實，懸掛通風(fēng)干燥處晾干。冬古子含有三萜皂苷、有機(jī)酸、黃酮、皂苷、生物堿、糖類及色素等藥理活性成分。其中，皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類的一類較復(fù)雜的糖苷類化合物，廣泛存在于中草藥中[3]?，F(xiàn)有研究表明[4]，皂苷具有抗菌、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抗癌等生物活性。近幾年國內(nèi)外學(xué)者很少有針對冬古子中皂苷藥理活性的研究，為深入研究冬古子中總皂苷的抑菌活性及其最優(yōu)提取方案，采用冷凝回流提取法，乙醇提取法（采用濃度、時間、溫度梯度）、丙酮提取法分別來提取冬古子果實中的總皂苷，再以四種常見菌（大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及乙型鏈球菌）作為實驗菌進(jìn)行藥物敏感實驗，并得出冬古子總皂苷的最佳抑菌濃度。

冬古子籽、冬古子皮、果實等的主要化學(xué)成分有脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、常見的微量元素等，但各自的比例不同，因此藥理作用也是稍有差別[5]。冬古子制品可用于治療咳嗽、胸悶等癥狀[6]。有研究發(fā)現(xiàn)地子匯總的揮發(fā)性油脂對癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒活性，冬古子子油具有降血糖以及改善糖耐量的作用[7]，此外，研究表明冬古子提取物具有抗肺纖維化、抗HIV活性等作用[8]。本研究結(jié)果表明，單因素試驗結(jié)果表明，提取冬古子總皂苷過程中溶劑最好為55%乙醇，料液比最好為1∶30，提取溫度最好為60℃，提取時間最好為35min。正交實驗結(jié)果分析：方差分析選出最佳提取方案，實驗1、2、3、4、5、6、7、8、9的MIC值分別為12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。因此實驗3為最佳提取方案，和上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，土家藥冬古子總皂苷提取工藝優(yōu)化能夠有效改善其體外抑菌活性，值得推廣。