成希飛 方廖瓊

(1. 西南大學(xué)教務(wù)處，重慶 400715; 2. 西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

隨著中國高等教育迅速發(fā)展，教育教學(xué)改革不斷深化，培養(yǎng)本科生的科研能力已成為強(qiáng)化素質(zhì)教育和深化高等教育改革的一項(xiàng)重要內(nèi)容[1]。教育部《關(guān)于一流本科課程建設(shè)的實(shí)施意見》中指出：一流本科課程教學(xué)內(nèi)容要體現(xiàn)前沿性與時(shí)代性，及時(shí)將學(xué)術(shù)研究、科技發(fā)展前沿成果引入課程。細(xì)胞生物學(xué)作為生物科學(xué)中發(fā)展最快的一門尖端學(xué)科，是生物、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)專業(yè)學(xué)生的學(xué)科必修課程，該門課程又包括理論與實(shí)驗(yàn)兩部分，其中《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程要求學(xué)生具有較好的實(shí)際操作與嚴(yán)謹(jǐn)思維能力[2]。越來越多的生物、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)專業(yè)的學(xué)生在完成本科學(xué)習(xí)之后進(jìn)入研究生階段深造學(xué)習(xí)，在研究生學(xué)習(xí)階段細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技能又是必需掌握的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技能之一。這就需要在本科階段的《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程教育中更加注重學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，加強(qiáng)學(xué)生科研思維能力及實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練。

傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)往往由于課時(shí)的限制，偏重于基礎(chǔ)性、驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。為了提升本科生對(duì)《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程的學(xué)習(xí)成效，部分高校進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，取得了良好的效果[3-6]，在很大程度上改善了原來教學(xué)內(nèi)容老舊、無連貫性以及以操作簡單的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為主等問題。本校生物技術(shù)專業(yè)的《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程同樣受到了越來越多的關(guān)注和重視，課程學(xué)時(shí)逐漸增多。從2014級(jí)開始，《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程學(xué)時(shí)由之前的18個(gè)學(xué)時(shí)增加至27個(gè)學(xué)時(shí)，內(nèi)容包括細(xì)胞大小的測定及計(jì)數(shù)、熒光顯微鏡及相差顯微鏡的使用、細(xì)胞器的分離及觀察、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞膜通透性的觀察、細(xì)胞骨架的觀察、細(xì)胞傳代培養(yǎng)及周期觀察、細(xì)胞融合共8項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。在最新制定的2018級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱中，《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程學(xué)時(shí)由27個(gè)學(xué)時(shí)增加至40個(gè)學(xué)時(shí)，對(duì)課程內(nèi)容也做出了相應(yīng)的調(diào)整，增加了開放性、綜合性實(shí)驗(yàn)；在原有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的基礎(chǔ)上增加了細(xì)胞凍存及復(fù)蘇、MTT法測定細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)方法做了改進(jìn)，改為熒光標(biāo)記的細(xì)胞融合觀察。新的《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱中還增加了細(xì)胞傳代培養(yǎng)及周期觀察實(shí)驗(yàn)的學(xué)時(shí)數(shù)，要求學(xué)生能夠熟練掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，并且在細(xì)胞培養(yǎng)過程中完成MTT法測定細(xì)胞活力及熒光標(biāo)記的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，將相關(guān)實(shí)驗(yàn)融合成為一個(gè)互相關(guān)聯(lián)的設(shè)計(jì)性、開放性實(shí)驗(yàn)，目的是增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣及動(dòng)手能力，同時(shí)也增強(qiáng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及查閱相關(guān)科技文獻(xiàn)的能力。

本文以熒光標(biāo)記的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)為例，闡述對(duì)實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)與方法進(jìn)行改進(jìn)的重要性?，F(xiàn)有《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》教材中細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)多以雞血紅細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料[7]，采用不同技術(shù)手段(主要包括PEG法、電擊法等)[8]誘導(dǎo)細(xì)胞融合，通過普通生物顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)判斷細(xì)胞是否發(fā)生融合。以熒光標(biāo)記的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)將小鼠淋巴瘤細(xì)胞(Yac-1)作為實(shí)驗(yàn)材料，在原有細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)如下：通過采用DiO和DiI兩種熒光探針分別標(biāo)記細(xì)胞，DiO標(biāo)記的細(xì)胞膜只在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，DiI標(biāo)記的細(xì)胞膜只在綠色激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光；采用PEG4000溶液誘導(dǎo)Yac-1細(xì)胞進(jìn)行融合，并用DAPI熒光染料標(biāo)記細(xì)胞核。采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，融合了的細(xì)胞膜會(huì)發(fā)出被DiO和DiI標(biāo)記產(chǎn)生2種顏色的熒光，細(xì)胞核通過DAPI染色后會(huì)發(fā)出藍(lán)紫色熒光。以熒光標(biāo)記的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)方法新穎，不僅更加利于對(duì)細(xì)胞是否發(fā)生融合進(jìn)行觀察，而且有利于啟發(fā)學(xué)生的科研思維和增強(qiáng)其實(shí)驗(yàn)操作能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料為小鼠淋巴瘤細(xì)胞Yac-1細(xì)胞株，由西南大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心保存。

1.2 主要試劑和儀器

PEG4000(重慶川東化工有限公司)，1640培養(yǎng)基(上海ExCell公司)，胎牛血清、雙抗、Hanks液(帶離子)、DiO、DiI、DAPI均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

水浴鍋(上海柏欣儀器設(shè)備廠)，3111二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，BK-FL熒光顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞標(biāo)記

參照文獻(xiàn)[9]的方法。選擇生長狀態(tài)良好的Yac-1細(xì)胞，取0.5 mL細(xì)胞懸液(106個(gè)/mL左右)于2根離心管中，使用低速離心機(jī)1 000×g離心10 min，棄去上清液。加入0.5 mL完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清及1%雙抗)，充分吹打重懸細(xì)胞，1 000×g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)1次，充分洗凈細(xì)胞。分別在2根離心管中加入40 μL DiO或DiI(60 μmol/L，使用DMSO配制)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中保溫30 min。

1.3.2 細(xì)胞融合

用Hanks液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%～50%的PEG溶液1 mL，放入37 ℃水浴鍋中備用。將標(biāo)記好的細(xì)胞懸液1 000×g離心5 min，棄去上清，2管中分別加入5 mL Hanks液，用吸管將細(xì)胞吹散，混勻2管細(xì)胞，然后1 000×g離心5 min，棄去上清，剩余液體1 mL左右，用吸管緩慢地將細(xì)胞團(tuán)塊吹散。取預(yù)熱的PEG溶液1 mL，在1 min內(nèi)滴加到細(xì)胞懸液中，注意控制時(shí)間，滴加速度不可過快或過慢，邊滴加邊輕輕搖動(dòng)混勻。待PEG全部加入后靜置3 min。緩慢滴加10 mL Hanks液以終止PEG的作用，在37 ℃水浴內(nèi)靜置5 min。離心棄上清，剩余2 mL左右液體，混勻后制備裝片，再加入5 μL DAPI染料，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

在細(xì)胞融合之前，用DiO標(biāo)記的Yac-1細(xì)胞的細(xì)胞膜在藍(lán)光下會(huì)發(fā)出綠色熒光，DiI標(biāo)記的細(xì)胞膜會(huì)在綠光下發(fā)出紅色熒光。細(xì)胞融合成功之后，融合的細(xì)胞會(huì)同時(shí)發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核會(huì)發(fā)出藍(lán)紫色熒光(圖1)。由圖1-A和B可以明顯地看出，只有細(xì)胞膜既能發(fā)出綠色熒光，又能發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞為融合細(xì)胞。如圖1-A、C左下方的3個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核具有藍(lán)紫色熒光而細(xì)胞膜只能發(fā)出綠色熒光，而在圖1-B中未顯示，說明此3個(gè)細(xì)胞為未融合細(xì)胞。

圖1 熒光顯微鏡下觀察到小鼠淋巴瘤細(xì)胞(Yac-1)間的融合

3 討 論

3.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)的益處

傳統(tǒng)細(xì)胞融合的觀察方法有較大的局限性：采用普通生物顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，緊挨著的2個(gè)細(xì)胞無法判斷到底是發(fā)生融合還是由于細(xì)胞分散不好形成的細(xì)胞團(tuán)塊，這就會(huì)造成融合率計(jì)算不準(zhǔn)確，并且細(xì)胞核是否融合也不容易被觀察到。改進(jìn)后實(shí)驗(yàn)方法較原來相比有了明顯進(jìn)步，用熒光顯微鏡可觀察到融合的細(xì)胞會(huì)在藍(lán)光與綠光下同時(shí)發(fā)出綠色和紅色熒光，而且通過對(duì)細(xì)胞核的熒光標(biāo)記對(duì)比融合的細(xì)胞核體積會(huì)有所增大，因此用改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法可以幫助學(xué)生更加清晰、準(zhǔn)確地觀察細(xì)胞融合的過程。此外，用改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)驗(yàn)前還要求學(xué)生查閱科研文獻(xiàn)，了解細(xì)胞融合所需PEG溶液的濃度以及滴加PEG溶液的時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件，并且要求學(xué)生在一定范圍內(nèi)按照參考文獻(xiàn)的結(jié)果來優(yōu)化設(shè)置擬開展實(shí)驗(yàn)的條件。這樣的施教方式既鍛煉了學(xué)生查閱科研文獻(xiàn)的能力，又增強(qiáng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性，改變了學(xué)生以往只是按照老師設(shè)置的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)操作的被動(dòng)學(xué)習(xí)方法，真正達(dá)到了實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)目的。

3.2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中的注意事項(xiàng)

細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)細(xì)胞融合的影響很大，所以熒光標(biāo)記細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞要處于生長旺盛期，且生長狀態(tài)較好。本實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)為各小組獨(dú)立培養(yǎng)Yac-1細(xì)胞，然后采用各自小組培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)不好的小組，其后續(xù)的實(shí)驗(yàn)很容易失敗，在熒光顯微鏡下無法找到熒光標(biāo)記的細(xì)胞。因此，要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)的各項(xiàng)操作，例如PEG溶液滴加時(shí)需不斷搖晃離心管，以免造成細(xì)胞懸液局部PEG濃度過高而損傷細(xì)胞。

4 結(jié) 語

細(xì)胞融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[10]、腫瘤研究[11]、克隆抗體[12]、作物育種[13]、環(huán)境微生物學(xué)[14]等領(lǐng)域。本次熒光標(biāo)記細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)，將傳統(tǒng)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)方法轉(zhuǎn)化成綜合性實(shí)驗(yàn)，并融合多種技術(shù)手段，使學(xué)生通過清晰、準(zhǔn)確的觀察對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)有更深一步的了解，有利于激發(fā)他們對(duì)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的濃厚興趣。

隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展的日新月異以及細(xì)胞生物學(xué)在生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越普遍，對(duì)本科階段的《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)進(jìn)行改革勢在必行[15]。今后將進(jìn)一步通過對(duì)教學(xué)方法、教學(xué)內(nèi)容、評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)等進(jìn)行改革，將經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法與現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，以期更好地培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維、創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力[16]。