陸玉芳，施衛(wèi)明

（土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

大量施用氮肥為作物增產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)，維持了全世界 70 多億人口的糧食供應(yīng)[1]。在目前產(chǎn)量水平下，我國三大糧食作物水稻、小麥、玉米每季推薦施氮量范圍大致為150～250 kg·hm-2（以N計(jì)，下同）[2-4]，但我國很多田塊的氮肥施用量達(dá)到了250～350 kg·hm-2[5]。由于過量施肥和不合理的管理措施[6]，我國目前主要糧食作物的當(dāng)季氮肥利用率僅為 30%～40%[4，7-8]，明顯低于一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū) 40%～60% 的水平[9]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的統(tǒng)計(jì)資料[10]，我國氮肥年用量為3 000萬t，持續(xù)高量的氮肥投入造成農(nóng)業(yè)氮素?fù)p失嚴(yán)重，引發(fā)水體富營養(yǎng)化、溫室氣體排放和土壤酸化等一系列生態(tài)環(huán)境問題[11-12]。因此，如何在現(xiàn)有施肥和生產(chǎn)模式下，達(dá)到提高作物氮素利用率和降低氮素環(huán)境污染的目的[8，13]，成為新形勢(shì)下我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要需求。

這種氮素利用率低和氮污染的困境與氮高度活躍及其轉(zhuǎn)化過程多樣有關(guān)。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，有機(jī)氮會(huì)通過礦化作用轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮銨態(tài)氮會(huì)通過硝化作用轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮無機(jī)態(tài)的容易被植物吸收利用會(huì)通過反硝化作用轉(zhuǎn)化成N2O和N2，也會(huì)通過厭氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation，anammox）和硝酸鹽異化還原為銨（dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA）過程轉(zhuǎn)化為N2和，N2再通過生物固氮作用進(jìn)入土壤轉(zhuǎn)化為氨。然而，隨著氮肥大量施用，土壤中未被農(nóng)作物吸收的和會(huì)損失至環(huán)境中，如硝化作用產(chǎn)生的會(huì)隨淋溶途徑進(jìn)入水體造成富營養(yǎng)化，硝化和反硝化作用產(chǎn)生的N2O 氣體會(huì)加劇溫室效應(yīng)，此外還會(huì)有氨揮發(fā)損失[14]。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)氮循環(huán)中，硝化作用與氮素?fù)p失和利用密切相關(guān)，成為提高氮素利用率和減少氮污染的關(guān)鍵過程[15-16]。合理抑制硝化作用是高投入條件下走出氮素管理困境的有效途徑之一。

利用化學(xué)合成硝化抑制劑（synthetic nitrification inhibitors，SNIs）是減少氮流失風(fēng)險(xiǎn)和提高氮肥利用率的一項(xiàng)重要措施，在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了較普遍的應(yīng)用。目前在農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用的 SNIs 有 3 種：（1）雙氰胺（dicyandiamide，DCD），（2）3,4-二甲基吡唑磷酸鹽（3,4-dimethylpyrazole phosphate，DMPP），（3）2-氯-6-三氯甲基吡啶（2-chloro-6-trichloromethyl pyridine，nitrapyrin）。通過 Meta 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，SNIs 和尿素同時(shí)使用能顯著減少 48% 的淋溶，44% 的 N2O 排放[17-18]，同時(shí)增加 7.5% 的作物產(chǎn)量和 12.9% 的氮素利用率（nitrogen use efficiency，NUE）[19]。SNIs 的有益效果受環(huán)境因子（如土壤pH、質(zhì)地、溫度）和農(nóng)藝管理措施（如灌溉和氮肥用量）的影響[19]。由于能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中規(guī)模應(yīng)用的SNIs 品種非常有限，且多為化工產(chǎn)品，其應(yīng)用不僅會(huì)增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，還可能對(duì)環(huán)境和食品安全造成潛在威脅[20-21]。因此，在我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的要求下，有必要尋求控制硝化作用的環(huán)境友好替代方案。本文針對(duì)生物硝化抑制劑在提高氮素利用率和減少氮環(huán)境污染方面的研究進(jìn)展及其重要作用進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)。

1 生物硝化抑制劑在生態(tài)系統(tǒng)中的意義

2006年，日本國際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心Subbarao高級(jí)研究員正式提出了“生物硝化抑制作用（biological nitrification inhibition，BNI）”的概念，它是指植物根系產(chǎn)生和分泌能抑制土壤硝化作用物質(zhì)的能力；植物根系產(chǎn)生和分泌的抑制硝化作用的物質(zhì)，則稱為生物硝化抑制劑（biological nitrification inhibitors，BNIs）[22]。事實(shí)上，早在20世紀(jì)六七十年代，研究人員就發(fā)現(xiàn)在森林和草地生態(tài)系統(tǒng)中，包括樹木、灌木、草、草藥和苔蘚等植物組織中有BNI活性[23-24]，從而推測(cè)根系分泌的BNIs是驅(qū)動(dòng)生態(tài)系統(tǒng)演替的關(guān)鍵機(jī)制。

研究普遍發(fā)現(xiàn)，在氮營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中生長的植物通常具有BNI活性。短梗苞茅（Hyparrhenia diplandra）和非洲濕身臂形草（Brachiaria humidicola）這兩種熱帶草受到的關(guān)注較多，田間試驗(yàn)表明它們生長的土壤硝化潛勢(shì)和硝酸鹽含量低[25-28]。Subbarao等[29]隨后通過生物化學(xué)發(fā)光法發(fā)現(xiàn)Brachiariahumidicola的根系具有最強(qiáng)的BNI活性。Janke等[30]指出澳大利亞當(dāng)?shù)匚锓N木槿（Hibiscus splendens）和刺茄（Solanum echinatum）的根系分泌物具有BNI活性，而它們正是生長在氮素養(yǎng)分缺乏的貧瘠土壤中。最近，研究人員在硝化速率低的溫帶森林樹木歐洲云杉（Picea abies）和高加索冷杉（Abies nordmanniana）組織中也發(fā)現(xiàn)了BNI功能[31]?？梢姡珺NIs可能是植物適應(yīng)低氮環(huán)境的一種保氮生存機(jī)制[25，29]。

與自然生態(tài)系統(tǒng)以及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)耕作體系相比，現(xiàn)代高投入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)體系土壤的硝化作用迅速，硝化速率增加了數(shù)倍[32]，BNIs 對(duì)于農(nóng)田土壤硝化過程的調(diào)控值得關(guān)注。一些早期研究表明，適應(yīng)高氮環(huán)境的植物BNI能力通常較弱。在牧草中，黍?qū)伲≒anicumspp.）相對(duì)于臂形草屬（Brachiariaspp.）更適應(yīng)高氮環(huán)境，其根系BNI活性較弱[29]；在大田作物中，適應(yīng)低氮投入的高粱（Sorghum bicolor）根系分泌物有顯著的BNI能力，而在高氮環(huán)境生長的水稻（Oryza sativaL.）、小麥（Triticum aestivum）和玉米（Zea maysL.）卻無硝化抑制活性[29]。但是相關(guān)的研究涉及的作物品種并不多，僅關(guān)注了糧食作物的單個(gè)品種，這很有可能忽視了BNI在三大糧食作物中的重要作用。最近O'Sullivan 等[33]對(duì)98種基因型小麥的調(diào)查研究，推翻了基于單一品種小麥幾乎不具有BNI或無BNI的觀點(diǎn)。該研究表明，目前使用的幾種地方品種和兩個(gè)商業(yè)品種的根系分泌物均具有顯著的BNI活性。此外，BNI在硝化作用弱的水作植物中不重要的觀點(diǎn)也很快被扭轉(zhuǎn)。Pariasca Tanaka 等[34]在一項(xiàng)對(duì)36種水稻基因型根系分泌物的研究中發(fā)現(xiàn)約有半數(shù)品種具有明顯的BNI作用。施衛(wèi)明研究員課題組通過19種水稻基因型的篩選實(shí)驗(yàn)表明，秈稻和粳稻的根系分泌物均具有較強(qiáng)的BNI活性，進(jìn)一步通過根系分泌物精細(xì)分離和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）鑒定技術(shù)，首次明確了水稻分泌的BNIs 物質(zhì)是1,9-癸二醇[35]。盡管目前尚未有證據(jù)表明玉米具有BNI功能，然而在玉米廣闊的遺傳資源背景下過早地排除其BNI功能還為時(shí)尚早[14]。鑒于水稻、小麥和玉米等糧食作物的氮肥投入強(qiáng)度和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)作物BNI的研究將對(duì)氮肥減施增效具有重要意義。可見，BNIs 在高量氮投入的農(nóng)業(yè)中同樣能發(fā)揮一定作用，具有減少農(nóng)田氮素流失和提高作物氮素利用的潛能[14，36]（圖1）。

2 根系分泌生物硝化抑制劑的種類與功能

2.1 生物硝化抑制劑的種類

盡管目前已明確了草類、樹木和作物等根系分泌物的BNI活性，但對(duì)具體起作用的關(guān)鍵BNIs 物質(zhì)了解甚少，而只有真正揭開它們的面紗，才能有的放矢地服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。早期對(duì)于BNI化學(xué)物質(zhì)的識(shí)別局限于植物組織或土壤提取物[37-39]，而不是根系分泌物，其中原因之一可能是根系分泌物含量低、易分解、干擾物質(zhì)多，收集和分離難度較大。然而相對(duì)于植物組織提取物，根系主動(dòng)分泌的BNIs更可能具有BNI作用[33]，挖掘根系分泌物中的BNIs物質(zhì)將更有意義。近十年來，隨著根系分泌物收集、分離和鑒定技術(shù)的快速發(fā)展，已從高粱、濕身臂形草和水稻的根系分泌物中發(fā)現(xiàn)了5 種BNIs（表1）。

表1 根系分泌生物硝化抑制劑的種類和效果Table 1 Types and effects of biological nitrification inhibitors exuded from roots

2008年，從高粱一個(gè)高BNI活性品種Sorghum bicolor根系分泌物中發(fā)現(xiàn)了第一種BNIs——對(duì)羥基苯丙酸甲酯（methyl 3-（4-hydroxyphenyl）propionate，MHPP），該苯丙酸類物質(zhì)具有中等的BNI活性[39]。隨后，Subbarao 等[40]又從高粱中發(fā)現(xiàn)了2 種BNIs，分別是親水性組分中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物櫻花素（sakuranetin），以及從疏水性組分中發(fā)現(xiàn)的苯醌類化合物高粱酮（sorgoleone），該物質(zhì)對(duì)高粱根系分泌物BNI活性具有主導(dǎo)作用。該團(tuán)隊(duì)2009年還從Brachiaria humidicola根系分泌物中發(fā)現(xiàn)了一種環(huán)狀二萜物質(zhì)，命名為臂形草內(nèi)酯（brachialactone）[41]，它是濕身臂形草根系分泌物中的BNI主導(dǎo)物質(zhì)，貢獻(xiàn)率達(dá)60%～90%。最新的一種根系分泌BNIs 來自國內(nèi)施衛(wèi)明研究員團(tuán)隊(duì)，他們從水稻中發(fā)現(xiàn)了脂肪醇類化合物1,9-癸二醇（1,9-Decanediol），這是三大糧食作物中發(fā)現(xiàn)的首個(gè)BNIs，相比于已知的BNIs物質(zhì)抑制活性處于中等水平，但效果顯著優(yōu)于已在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中普遍應(yīng)用的DCD[35]。

然而，上述BNIs物質(zhì)的功能驗(yàn)證是在單個(gè)歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaea）的純培養(yǎng)體系中進(jìn)行的，在復(fù)雜土壤體系中的效果尚有待考證[32]。研究發(fā)現(xiàn)，臂形草[36]、水稻[33]和小麥多個(gè)品種[34]根系分泌物總組分BNI活性在純菌培養(yǎng)和土壤體系下的效果一致，這為后期從作物遺傳群體中篩選高BNI活性品種提供了重要依據(jù)。對(duì)于具體BNIs化學(xué)物質(zhì)，來自臂形草的臂形草內(nèi)酯由于化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品難獲得，尚無證據(jù)證明其在土壤中的效果[41]。高粱BNIs MHPP和高粱酮在中性土壤中表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)[40，42，44]，而親水性物質(zhì)櫻花素添加至土壤后卻失去了活性[40]。最新研究還證實(shí)，水稻源1,9-癸二醇對(duì)我國三種典型農(nóng)田土壤（堿性潮土、中性水稻土和酸性紅壤）硝化活性均有顯著抑制作用[44]。未來單個(gè)BNIs物質(zhì)的功能驗(yàn)證建議考察其在不同土壤類型下的效果。

高粱根系分泌物中具有疏水性BNIs和親水性BNIs共存的現(xiàn)象，表明 BNIs 在作用方式上可能是空間分離的，疏水性、遷移能力弱的BNIs 在根際占主導(dǎo)，而親水性的物質(zhì)能擴(kuò)散至根系較遠(yuǎn)的距離起作用[40]。此外，在土壤環(huán)境中具有獨(dú)特生化活性的不同BNIs 共存時(shí)，可能會(huì)發(fā)生疊加和協(xié)同作用[44-45]，這通常是純菌株體系下的生物活性研究忽略的。這一定程度上能解釋根系分泌物總組分在土壤中有BNI活性，而單個(gè)BNIs 無顯著效果的現(xiàn)象，可能與不同BNIs之間的時(shí)空協(xié)同效應(yīng)有關(guān)，值得進(jìn)一步關(guān)注。

2.2 生物硝化抑制劑的功能

植物產(chǎn)生BNIs是對(duì)硝化環(huán)境的特定響應(yīng)，還是它們具有多種的生化功能，抑制硝化作用僅是巧合的副作用？事實(shí)上，植物產(chǎn)生和分泌的BNIs 具有很多氮代謝以外的功能，例如，濕身臂形草葉中的關(guān)鍵BNIs物質(zhì)α-亞麻酸是植物細(xì)胞膜的主要成分[46]，高粱根系分泌的高粱酮是一種常見的化感物質(zhì)和除草劑[47]。然而，O'Sullivan 等[33]認(rèn)為如果化合物從根部主動(dòng)分泌，而不是通過隨機(jī)過程（如凋落物分解和膜滲漏）釋放，更可能具有特定的BNI作用。他們發(fā)現(xiàn)在小麥不同品種組織與根系分泌物中BNIs的活性無顯著相關(guān)性，表明不同BNIs具有功能特異性和獨(dú)立性。Pariasca Tanaka等[34]也提出水稻分泌BNIs 是一個(gè)膜調(diào)節(jié)的過程而不是被動(dòng)的非特異性組織滲漏過程。

根系BNIs的分泌通常受根際環(huán)境因子的特異誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，根系在接觸時(shí)有一個(gè)快速和明顯的BNIs分泌，而接觸后卻無響應(yīng)。這個(gè)現(xiàn)象在濕身臂形草[41]，高粱[39]、小麥野生近緣物種大賴草[46]和水稻[48]中均加以了證實(shí)，增強(qiáng)了人們對(duì)BNIs具有特定功能的信心。而且，在高粱中發(fā)現(xiàn)這種誘導(dǎo)與根細(xì)胞中質(zhì)膜（PM）H+-ATPases的活性及NH3同化有關(guān)[49-50]。此外，在水稻中發(fā)現(xiàn)根際良好的通氣情況有利于水稻分泌更多1,9-癸二醇（圖2），研究人員猜想根系分泌BNIs和根系泌氧這兩個(gè)對(duì)硝化作用一正一反的生物學(xué)過程可能共同調(diào)控根際硝化強(qiáng)度[48]，維持合理銨硝比，從而有利于水稻的氮素吸收和生長[51]。更有趣的是，在水稻中還發(fā)現(xiàn)根際亞硝化細(xì)菌的存在能特異刺激1,9-癸二醇的分泌（圖2），而反硝化細(xì)菌卻無此誘導(dǎo)效應(yīng)[48]。而硝化細(xì)菌對(duì)1,9-癸二醇的特異誘導(dǎo)可能與微生物分泌的群體感應(yīng)（QS）信號(hào)分子有關(guān)（陸玉芳等，未發(fā)表數(shù)據(jù)），進(jìn)一步表明BNIs可能是植物-微生物根際互作中的特定化學(xué)信號(hào)物質(zhì)。而且，19個(gè)水稻品種根系分泌物的BNI活性、1,9-癸二醇含量與銨態(tài)氮利用和偏好正相關(guān)[35]。上述研究均說明了植物根系感應(yīng)到有利于硝化環(huán)境的因子后，能主動(dòng)分泌BNIs的特定信號(hào)物質(zhì)，調(diào)控根際硝化強(qiáng)度至適宜范圍內(nèi)。

BNIs受環(huán)境特異誘導(dǎo)產(chǎn)生后，還存在著功能分配的特點(diǎn)，即BNIs在根際除了抑制微生物硝化過程外，還可能在土壤-植物-微生物互作系統(tǒng)起其他信號(hào)作用。以高粱分泌的BNIs 物質(zhì)MHPP為例，中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園徐進(jìn)研究員團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了MHPP對(duì)根構(gòu)型塑造的信號(hào)調(diào)控功能[52]。MHPP主要通過干擾一氧化氮/活性氧（NO/ROS）的生長素信號(hào)途徑，從而抑制Arabidopsis thaliana根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂及主根伸長[52]。值得注意的是，的調(diào)控。如上文提到的，根際氮形態(tài)對(duì)BNIs的分泌具有重要影響，供能顯著促進(jìn)植物分泌BNIs，而在環(huán)境中的植株幾乎不分泌BNIs[39，41，46，48]。此外，BNIs的分泌還受根際濃度的影響。在0～1 mmol·L-1時(shí)，高粱BNIs分泌量隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，但當(dāng) NH+4大于1 mmol·L-1時(shí)，BNIs的分泌不再提高[50]，在水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[48]。而且，最新的研究還發(fā)現(xiàn)，根際良好的通氣情況和硝化細(xì)菌能促進(jìn)水稻分泌更多1,9-癸二醇，而反硝化細(xì)菌卻無此誘導(dǎo)效應(yīng)[48]，這表明水稻根系BNIs 與硝化細(xì)菌之間存在著化學(xué)信號(hào)交流，但具體的信號(hào)互作機(jī)制尚缺乏研究。總體而言，BNIs似乎受到有利于硝化環(huán)境的影響因子誘導(dǎo)。

3 生物硝化抑制劑的分泌與作用機(jī)制

3.1 生物硝化抑制劑的分泌機(jī)制

在更微觀水平上，目前在BNIs從根系分泌的分子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制方面也取得了一定進(jìn)展。由于化學(xué)性質(zhì)的差異，親水性BNIs和疏水性BNIs的相關(guān)分子機(jī)制有所不同。親水性BNIs 屬于陰離子物質(zhì)，很可能通過陰離子通道釋放[49]。質(zhì)膜H+-ATP酶對(duì)高粱親水性BNIs（MHPP）的分泌起了重要作用，且與根系細(xì)胞中吸收和同化密切相關(guān)[49-50]。最近通過對(duì)三種基因型高粱的分析，進(jìn)一步證實(shí)根際（≤1.0 mmol·L-1）和低pH促進(jìn)了根系質(zhì)膜H+-ATP酶活性，并通過電壓依賴性的陰離子通道將帶負(fù)電荷的親水性BNIs轉(zhuǎn)運(yùn)出質(zhì)膜[55]。該研究同時(shí)也指出，高粱疏水性BNIs的分泌與根際pH關(guān)系不明顯，與高粱的基因型有關(guān)。Hybridsorgo基因型中疏水性BNIs的分泌不隨pH變化，但在PVK801和296B基因型中卻隨pH升高而增強(qiáng)，這表明高粱疏水性BNIs的分泌可能依賴于其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在水稻中，Zhang等[48]卻發(fā)現(xiàn)疏水性1,9-癸二醇的分泌同樣受根際低pH的誘導(dǎo)。這也是水作植物水稻相比旱作植物高粱的另一個(gè)分泌機(jī)制差異。

作為一種中性不帶電的脂肪醇類化合物，1,9-癸二醇在細(xì)胞中不易受到離子極化作用，可能會(huì)通過腺苷三磷酸結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或多藥和有毒化合物排出家族（MATE）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。值得注意的是，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被證明可介導(dǎo)根系分泌物的釋放，如脂肪酸和黃酮類物質(zhì)[56]，而1,9-癸二醇屬于脂肪酸衍生物，櫻花素與黃酮屬于同一化學(xué)物質(zhì)類別。Badri等[57]利用擬南芥突變體材料直接證明脂肪酸類化合物3-羥基-順-4,6,8,10-四烯酸受ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。這項(xiàng)研究同時(shí)也指出同一種化合物可由不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，如反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而一些BNIs可能正是通過該蛋白家族成員釋放的，如黃酮類物質(zhì)[58]。這兩類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否真正參與了BNIs的分泌尚有待進(jìn)一步證明，但已知的根系分泌物從植物細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)與釋放途徑能為BNIs的分泌機(jī)制提供理論參考。自由擴(kuò)散和囊泡運(yùn)輸是另外兩種常見的根系分泌物轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[56]。BNIs 物質(zhì)分子量較大，具有電荷或極性，且很多BNIs（如高粱酮）具有潛在的細(xì)胞毒性，通過自由擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性不大[8]。根系分泌的高分子量物質(zhì)通常涉及囊泡運(yùn)輸途徑，如高粱酮，通過超微結(jié)構(gòu)分析在高粱根毛中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞富含囊泡[59]。然而，高粱酮分泌的具體分子機(jī)制目前尚不清楚，是否還有其他BNIs如臂形草內(nèi)酯，通過類似過程釋放也有待進(jìn)一步研究。根據(jù)以上結(jié)果，本文提出了根系分泌BNIs由植物細(xì)胞膜釋放的機(jī)制假說（圖3）。

3.2 生物硝化抑制劑的作用機(jī)制

氨氧化是氨（NH3）氧化為亞硝酸鹽（NO2-）的生物學(xué)過程，被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟，由氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）、氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea，AOA）和近年來新發(fā)現(xiàn)的全程硝化菌（complete ammonia oxidizer，comammox）主導(dǎo)。AOB 是高氮投入下的中性和堿性土壤環(huán)境中硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)者[60]，而AOA 由于對(duì)底物 NH3的親和力更高，在低氮和強(qiáng)酸性土壤環(huán)境中占主導(dǎo)[61]?；诨蚪M序列，comammox 似乎具有廣泛的代謝通用性，因此可能在多種環(huán)境中具有競爭力[62]。三者生態(tài)位的分化可能是由于它們?cè)诎毖趸緩街械倪M(jìn)化差異導(dǎo)致的[63]。氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）和羥胺氧化還原酶（hydroxylamine oxidoreductase，HAO）是AOB、AOA和 Comammox 進(jìn)行氨氧化的關(guān)鍵酶。AOB 的 AMO 三聚體膜結(jié)合蛋白由 amoA、amoB 和 amoC 3個(gè)亞基組成，其中 amoA 是 AMO的活性多肽位點(diǎn)。相對(duì)于AOB，AOA的氨氧化途徑尚不清晰，但基因組分析表明 AOA 具有編碼 3個(gè)亞基的獨(dú)特同源基因，且體內(nèi)包含ORF38或amoX基因，可能會(huì)編碼第四個(gè)AMO亞基[64]；此外，AOA 的amoB 活性位點(diǎn)不保守，且缺少編碼 HAO基因。與AOB 相似，comammox 含有編碼 AMO 和 HAO 的amo和hao基因，但與AOB 不同的是，comammox僅有一個(gè)amoCAB啟動(dòng)子區(qū)域，有 2 個(gè)其他的amoC基因，但總體上與 AOB 關(guān)系最密切。

目前在農(nóng)業(yè)上廣泛使用的SNIs（DCD，nitrapyrin和DMPP），主要作為競爭性底物或金屬螯合劑結(jié)合amoB亞基的活性位點(diǎn)Cu起抑制作用[65]。Nitrapyrin還能作為amoB的替代底物，其產(chǎn)物將對(duì)氨氧化產(chǎn)生不可逆的影響[66]。但BNIs在生化層面的作用方式尚缺乏研究。在菌株純培養(yǎng)體系下，DCD和nitrapyrin僅能作用于AMO，卻對(duì)HAO無效果[39，41]，而大多數(shù)根系分泌的BNIs（臂形草內(nèi)酯、高粱酮和櫻花素）卻能同時(shí)抑制Nitrosomonas europaeaAMO和HAO的活性[14，41]（表 2），包括Brachiaria humidicola地上部組織中發(fā)現(xiàn)的亞麻酸和亞油酸[38]。而且，臂形草、小麥近緣種和高粱的根系分泌物總組分也能同時(shí)抑制AMO和HAO的活性[39，41，45]。由此可見，BNIs可能較SNIs調(diào)控更多的硝化酶位點(diǎn)。

表2 主要生物硝化抑制劑和化學(xué)合成硝化抑制劑的作用機(jī)制Table 2 Mechanism of the main biological nitrification inhibitors and chemical nitrification inhibitors

在調(diào)控硝化微生物種類方面，化學(xué)合成硝化抑制劑DCD、 nitrapyrin 和DMPP大多數(shù)情況下僅對(duì)AOB有顯著抑制，對(duì)AOA基本無抑制作用[67]，這可能與AOA中amoB 亞基空間結(jié)構(gòu)與AOB不同有關(guān)。大量研究表明，植物分泌BNIs 似乎能作用于更多的氨氧化微生物種類。例如，Subbarao 等[41]通過田間實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種植高BNI活性的臂形草能同時(shí)抑制AOA和AOB豐度。Byrnes等[68]和Nu?ez等[69]也陸續(xù)證明臂形草根系分泌物能作用于AOA。在BNIs 化學(xué)物質(zhì)單獨(dú)添加的研究中，Nardi 等[44]證明BNIs 物質(zhì)MHPP能同時(shí)抑制土壤AOB和AOA豐度。Lu 等[43]利用土壤培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1,9-癸二醇添加能顯著抑制三種農(nóng)田土壤潮土、水稻土和紅壤的AOA和AOBamoA基因豐度。Sarr 等[70]利用盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高粱酮對(duì)土壤AOA豐度有顯著抑制?？梢?，BNIs具有同時(shí)抑制AOB和AOA的潛力。最新研究還明確了森林杉樹凋落物對(duì)硝化細(xì)菌（NOB）硝化桿菌屬（Nitrobacter）的調(diào)控作用[31]。除了AOB和AOA，后續(xù)研究建議同時(shí)關(guān)注comammox和NOB對(duì)BNIs的響應(yīng)。

氨氧化微生物對(duì)不同類型硝化抑制劑敏感性的變化可能是由于AMO酶或氨氧化途徑的差異，以及細(xì)胞差異引起的[67]。鑒于AOA和comammox對(duì)硝化作用的重要貢獻(xiàn)，目前僅對(duì)AOB有效果的SNIs有待升級(jí)。大多數(shù)情況下DCD和DMPP 等SNIs僅在AOB占主導(dǎo)的中性和堿性土壤中發(fā)揮作用，而能同時(shí)調(diào)控AOA和AOB的BNIs潛在應(yīng)用范圍將更廣泛，特別是在AOA占主導(dǎo)的酸性土壤上[43]，這是BNIs相比于SNIs的優(yōu)勢(shì)之一。事實(shí)上，除了能抑制AOB，能更廣譜地調(diào)控AOA和comammox的BNIs在土壤中的效果可能會(huì)更加持久[16]。而且，BNIs（或BNIs混合物）能作用于不同的氨氧化途徑或氨氧化微生物種類，降低環(huán)境中硝化微生物對(duì)硝化抑制劑的抗性[16]。此外，BNIs在實(shí)際土壤-植物系統(tǒng)中還具有時(shí)空持續(xù)、精準(zhǔn)釋放的特點(diǎn)，這是其優(yōu)于SNIs的另一大優(yōu)勢(shì)，而SNIs在土壤中有效期普遍較短。

4 生物硝化抑制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用前景

BNIs環(huán)境友好，在農(nóng)業(yè)上具有溫室氣體減排、氮素增效和作物豐產(chǎn)的潛力[14，72]，但目前尚缺乏BNIs的田間實(shí)際應(yīng)用研究。研究人員多年來一直在探尋高效利用BNI功能的方法，其中種植高BNI活性的植物或直接覆蓋牧草組織是減少農(nóng)業(yè)環(huán)境中N2O排放和提高氮素利用率的有效途徑之一。最經(jīng)典的例子來自Subbarao等[41]哥倫比亞熱帶國際農(nóng)業(yè)中心的3年田間實(shí)驗(yàn)，與大豆或?qū)φ赵囼?yàn)小區(qū)相比，種植高BNI活性的臂形草試驗(yàn)小區(qū)抑制了90%的N2O排放。Byrnes 等[68]將高 BNI 活性熱帶牧草B. humidicola（CIAT 679）組織覆蓋至土壤牛尿斑塊后，發(fā)現(xiàn)N2O排放較低BNI活性的牧草B. hybrid‘Mulato' 減少了60%。BNI的田間應(yīng)用也逐漸拓展至蔬菜和糧食作物上。Zhang等[73]通過2年的蔬菜田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與BNI效應(yīng)強(qiáng)的高粱輪作后，菜地N2O排放量降低了18.1%，高于Nitrapyrin處理下的16.5%，而且蔬菜的氮素利用率提高了6.7%，產(chǎn)量增加了10.3 t·hm-2·a-1。Karwat等[74]在牧草-玉米輪作田間實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)種植高BNI活性牧草后顯著提高了后茬玉米的氮素利用率和產(chǎn)量。因此，這種高BNI活性植物（如牧草）與其他作物輪作的農(nóng)藝措施有望向農(nóng)民推廣應(yīng)用。

此外，BNIs 物質(zhì)作為新型的氮肥增效劑具有一定的產(chǎn)業(yè)化前景，然而這方面的研究正處于初級(jí)階段。在一項(xiàng)MHPP對(duì)秸稈和牛糞堆肥減排的野外研究中，人們發(fā)現(xiàn)0.6% MHPP 能減少N2O排放達(dá)62.39%[75]。Lu等[43]通過室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提供了BNIs 1,9-癸二醇減少農(nóng)田土壤N2O排放量的證據(jù)，明確1,9-癸二醇對(duì)三種農(nóng)田土壤N2O平均減排為48%，特別是在酸性紅壤上高達(dá)90%，效果顯著優(yōu)于DCD，這可能與1,9-癸二醇對(duì)AOA豐度和群落結(jié)構(gòu)的有效抑制有關(guān)。Sun 等[35]結(jié)合19個(gè)水稻品種室內(nèi)水培和15N同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水稻BNI活性、1,9-癸二醇含量與水稻銨態(tài)氮吸收正相關(guān)，表明1,9-癸二醇有提高作物氮素利用的潛力。目前迫切需要研究1,9-癸二醇等BNIs物質(zhì)的田間增效減排效果。

利用BNI性狀進(jìn)行作物遺傳改良是提高作物氮素利用率的一條新途徑。近年來研究人員一直嘗試解析調(diào)控BNI活性和BNIs 分泌的關(guān)鍵基因。不同品種熱帶牧草、高粱、小麥和水稻的根系分泌物BNI活性存在顯著變異[33-34，42，45]。在高粱中，其分泌的BNIs物質(zhì)高粱酮含量具有顯著的品種差異性[42]。在水稻中也發(fā)現(xiàn)19個(gè)水稻品種根系分泌的1,9-癸二醇與BNI活性呈顯著正相關(guān)[35]。這些結(jié)果為進(jìn)一步通過遺傳學(xué)方法克隆控制BNI活性或BNIs 分泌的關(guān)鍵基因位點(diǎn)提供了理論依據(jù)。在糧食作物中，Subbarao等[45]在前期發(fā)現(xiàn)小麥的一個(gè)野生近緣物種L. racemosus具有較高的BNI能力基礎(chǔ)上，利用QTL技術(shù)將控制BNI活性的遺傳位點(diǎn)定位于Lr#n染色體，并通過遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)成功導(dǎo)入小麥栽培品種中。澳大利亞O'Sullivan團(tuán)隊(duì)[33]在大量小麥地方品種中發(fā)現(xiàn)了BNI活性，增加了將BNI功能引入現(xiàn)代小麥品種的潛力。而且，該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在澳大利亞西南部廣泛生長的現(xiàn)代小麥品種Wyalkatchem具有中等的BNI活性，表明有必要將現(xiàn)代作物品種的測(cè)試范圍擴(kuò)大，進(jìn)一步簡化育種過程。在水稻中，研究人員也明確了現(xiàn)代水稻品種根系分泌物的BNI活性存在遺傳變異，并采用全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association study，GWAS）確定了調(diào)控水稻BNI活性的遺傳位點(diǎn)（施衛(wèi)明等，未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

5 研究展望

盡管BNIs 的研究目前處于起步階段，但在過去的十年中已取得了相當(dāng)多的進(jìn)展：從臂形草、高粱和水稻根系分泌物中BNIs 物質(zhì)的鑒定，到從現(xiàn)代小麥和水稻品種中發(fā)現(xiàn)了BNI活性，并揭示了BNI與氮素利用率的密切關(guān)系[35]。然而，為了更好地應(yīng)對(duì)當(dāng)今高投入條件下農(nóng)業(yè)的氮素困境，滿足農(nóng)業(yè)氮素管理的需求，有必要進(jìn)一步開發(fā)BNIs在根內(nèi)-根際-土壤系統(tǒng)中的重要功能，諸多關(guān)于BNIs 的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究值得深入：（1）繼續(xù)探索重要農(nóng)作物的BNI功能和BNIs物質(zhì)類型，并兼顧BNIs 物質(zhì)之間的互作關(guān)系；（2）進(jìn)一步探索已知BNIs 物質(zhì)抑制硝化的作用機(jī)理，除了氨氧化微生物AOA與AOB，還應(yīng)關(guān)注新發(fā)現(xiàn)的Comammox對(duì)BNIs的響應(yīng)，包括其他氮轉(zhuǎn)化過程如反硝化，而BNIs引起的氨揮發(fā)潛在損失也有待評(píng)估；（3）隨著分子生物學(xué)GWAS等先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)合國內(nèi)外廣泛的現(xiàn)代作物種質(zhì)資源，未來將有望在調(diào)控BNI和BNIs分泌的關(guān)鍵基因及其分子遺傳機(jī)制方面取得突破，為作物遺傳育種提供新的思路與理論依據(jù)；（4）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，應(yīng)盡快開展BNIs的田間實(shí)驗(yàn)，探究BNIs在不同土壤條件下和不同作物中的增效減排效果，同時(shí)嘗試開發(fā)基于BNIs的新型穩(wěn)定性肥料產(chǎn)品，并在田間進(jìn)行效果評(píng)估。

基于BNIs的新型肥料屬于環(huán)境友好型產(chǎn)品，未來有望部分替代化學(xué)合成硝化抑制劑，特別在有機(jī)農(nóng)業(yè)中有較廣闊的應(yīng)用前景，將對(duì)提升農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)安全，增強(qiáng)我國農(nóng)產(chǎn)品的國際競爭力具有重大意義。同時(shí)，開發(fā)BNIs 技術(shù)和產(chǎn)品也將有利于提升農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)附加值，推動(dòng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色、高效和可持續(xù)發(fā)展。