廖朝美，李杰章，游敏芳，譚光輝，張依裕

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

蛋殼質(zhì)量是家禽生產(chǎn)中的一個(gè)重要指標(biāo)，影響家禽生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和孵化率[1]。優(yōu)質(zhì)的蛋殼是抵御外界物理?yè)p傷和病原微生物侵入的重要防線[2]?？梢?，提高蛋殼質(zhì)量對(duì)于減少蛋殼破損帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。鈣是家禽蛋殼生物礦化過(guò)程中最為關(guān)鍵的礦物元素，占蛋殼質(zhì)量的38 %左右，直接影響蛋殼品質(zhì)[3]。1,4,5-三磷酸肌醇受體3型(IP3R3)是一種膜糖蛋白復(fù)合物，是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道，作為鈣離子通道能被肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)激活[4-5]。IP3受體(IP3R)是一個(gè)普遍存在的Ca2+通道，能介導(dǎo)Ca2+從細(xì)胞內(nèi)主要的Ca2+儲(chǔ)存細(xì)胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放[6]。當(dāng)IP3和Ca2+同時(shí)存在時(shí)，才可以達(dá)到對(duì)IP3R的最有效刺激，高濃度的IP3可以激活I(lǐng)P3R，引起Ca2+的釋放；同時(shí)，被激活的IP3R也可以激活鄰近的IP3R，使Ca2+快速釋放[7]。IP3R有3種亞型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)，分別由基因IP3R1、IP3R2和IP3R3編碼，具有很高的序列同源性[8]。相關(guān)研究結(jié)果表明，IP3R3可在雞的蛋殼腺中表達(dá)，且蛋殼腺中鈣的含量增加會(huì)促進(jìn)IP3R3的表達(dá)[9-11]?？梢?，IP3R3基因?qū)Φ皻は僦蠧a2+離子具有一定的調(diào)控作用。此外，大量研究結(jié)果表明，IP3R3基因中特異性單核苷酸多態(tài)性(SNP)與多種免疫介導(dǎo)的疾病有關(guān)，如1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病等[12-14]。

櫻桃谷鴨原產(chǎn)于英國(guó)，由北京鴨和埃利斯伯雜交選育而成，因生長(zhǎng)快、肉質(zhì)佳、產(chǎn)蛋率高、飼料轉(zhuǎn)化率高、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)受到養(yǎng)殖者的青睞[15]。隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，因蛋殼質(zhì)量相關(guān)問題導(dǎo)致的蛋損失率達(dá)10%～15%[16]。因此，提高蛋殼品質(zhì)是養(yǎng)禽業(yè)亟待解決的問題。近年來(lái)，對(duì)IP3R3的研究主要集中在調(diào)節(jié)信號(hào)通路上，而缺乏其基因多態(tài)性對(duì)禽類生產(chǎn)性能影響的相關(guān)報(bào)道。為此，選取櫻桃谷鴨為試驗(yàn)樣本，通過(guò)直接測(cè)序法研究IP3R3基因部分功能區(qū)SNP對(duì)櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)的影響，旨在為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇改善鴨蛋品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和蛋殼指標(biāo)

本試驗(yàn)使用的櫻桃谷鴨飼養(yǎng)于貴州大學(xué)家禽研究所，選擇同日出雛、健康無(wú)病、同等管理?xiàng)l件下的128只母櫻桃谷鴨，90日齡翅膀靜脈采血。在45周齡時(shí)，對(duì)每只母鴨連續(xù)7 d收集鴨蛋，以測(cè)定蛋質(zhì)量、蛋形指數(shù)、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼質(zhì)量5個(gè)指標(biāo)，對(duì)測(cè)量的指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

1.2 主要試劑和儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(DP304)購(gòu)自天根生化科技北京有限公司；2×EsTaqMaster Mix試劑、瓊脂糖和DL2000 Marker均購(gòu)自重慶擎科生物科技有限公司。

主要儀器：電泳儀(北京六一儀器廠)，梯度PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀和蛋品質(zhì)分析儀(北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司)，核酸濃度檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3 引物合成及目的片段擴(kuò)增

根據(jù)GenBank收錄的鴨IP3R3基因序列(NC_040072.1)，利用在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/index2.cgi)預(yù)測(cè)該基因的功能結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)MIR結(jié)構(gòu)域，查找DNA序列位置，利用在線軟件Primer 3.0(http://primer3.ut.ee/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物信息見表1。PCR擴(kuò)增采用20 μL體系：10 μL 2×EsTaqMaster Mix，1 μL DNA模板，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加入7 μL ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性8 min；95 ℃變性50 s,按表1中各引物對(duì)應(yīng)的退火溫度退火40 s,72 ℃延伸50 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。120 V電壓條件下,采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳25 min，凝膠成像儀檢測(cè)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)128只櫻桃谷鴨IP3R3基因的每個(gè)擴(kuò)增片段純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行直接測(cè)序，采用Chromas軟件進(jìn)行SNP篩查。參照文獻(xiàn)[17-18]的方法，用Excel 2019統(tǒng)計(jì)IP3R3各個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、基因型頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(He)和Hardy-Weinberg平衡定律適合性檢驗(yàn)結(jié)果。利用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/)網(wǎng)上在線軟件進(jìn)行單倍型及連鎖不平衡分析。參照文獻(xiàn)[19-20]的方法，采用SPSS 22.0軟件中的一般線性模型(Generalized linear models,GLM)單因素方差分析方法分析SNP基因型、雙倍型與蛋殼品質(zhì)的相關(guān)性，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃谷鴨IP3R3基因 SNP位點(diǎn)篩選

利用設(shè)計(jì)的2對(duì)特異引物對(duì)櫻桃谷鴨IP3R3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。將IP3R3基因原始序列和引物PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見圖2。在IP3R3基因MIR功能結(jié)構(gòu)域共發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為第6外顯子的g.5539186 T>C突變和第8外顯子g.5540404 G>A突變，2個(gè)SNP位點(diǎn)均產(chǎn)生3種基因型，g.5539186 T>C產(chǎn)生3種基因型TT、TC和CC，g.5540404 G>A產(chǎn)生3種基因型GG、GA和AA。2個(gè)SNP位點(diǎn)均未導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變，均為同義突變。

圖2 櫻桃谷鴨IP3R3基因SNP序列比對(duì)

2.2 櫻桃谷鴨SNP位點(diǎn)的群體遺傳分析

對(duì)櫻桃谷鴨IP3R3基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出，2個(gè)SNP位點(diǎn)在櫻桃谷鴨群體中均存在3種基因型，g.5539186 T>C位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型TT的頻率為0.492，優(yōu)勢(shì)等位基因T的頻率為0.703，多態(tài)信息含量為0.330，屬于中度多態(tài)突變位點(diǎn)(0.25A位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為GG，頻率為0.609，優(yōu)勢(shì)等位基因型G的頻率為0.785，多態(tài)信息含量為0.281，屬于中度多態(tài)。卡方(χ2)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位點(diǎn)產(chǎn)生的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 櫻桃谷鴨IP3R3基因SNP的群體遺傳信息

2.3 櫻桃谷鴨IP3R3基因的單倍型和連鎖不平衡分析

利用在線軟件SHEsis分析櫻桃谷鴨IP3R3基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡，結(jié)果見表3。由表3可知,g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位點(diǎn)之間D′和r2值分別為1.000和0.116，表明2個(gè)位點(diǎn)之間不存在強(qiáng)的連鎖不平衡(D′>0.75，r2>0.33)。

表3 櫻桃谷鴨IP3R3基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

由表4可見，2個(gè)SNP位點(diǎn)聯(lián)合共產(chǎn)生3種單倍型，優(yōu)勢(shì)單倍型H3(TG)的頻率為0.488，劣勢(shì)單倍型H2(TA)的頻率為0.215。對(duì)3種單倍型進(jìn)行組合得到5種雙倍型，優(yōu)勢(shì)雙倍型H1H3頻率為0.423，劣勢(shì)雙倍型H2H2頻率為0.039。

表4 櫻桃谷鴨IP3R3基因單倍型頻率分析

2.4 櫻桃谷鴨IP3R3基因各突變位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

利用SPSS 22.0軟件分析櫻桃谷鴨IP3R3基因的SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的相關(guān)性，結(jié)果見表5。從表5可以看出，g.5539186 T>C位點(diǎn)對(duì)蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋形指數(shù)、蛋質(zhì)量和蛋殼質(zhì)量的影響均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。g.5540404 G>A位點(diǎn)GG和GA基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度顯著高于AA基因型個(gè)體(P<0.05)，與其他蛋殼品質(zhì)之間未達(dá)到顯著(P>0.05)關(guān)聯(lián)水平。

表5 櫻桃谷鴨IP3R3基因SNP與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

2.5 櫻桃谷鴨雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)發(fā)現(xiàn)的5種雙倍型與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果見表6。由表6可知，雙倍型H1H1、H1H3、H2H3和H3H3個(gè)體的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度顯著高于H2H2個(gè)體的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度(P<0.05)，其他蛋殼品質(zhì)不存在顯著差異(P>0.05)。

表6 櫻桃谷鴨IP3R3基因SNP位點(diǎn)雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

3 結(jié)論與討論

IP3R3在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)中廣泛分布，能與三磷酸肌醇結(jié)合形成Ca2+通道而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[21-22]。IP3R3通道涉及將促凋亡的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)移到線粒體，IP3R3功能或表達(dá)的變化與腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞死亡抵抗有關(guān)[23]。譚光輝等[24]研究發(fā)現(xiàn),IP3R3基因在鴨的蛋殼腺部呈現(xiàn)高表達(dá)，且IP3R3基因可能在蛋殼腺內(nèi)通過(guò)調(diào)控Ca2+的釋放影響蛋殼的形成。禽類子宮內(nèi)分泌鈣離子是引起蛋殼質(zhì)量變異的關(guān)鍵因素，鈣離子受子宮內(nèi)多種基因的調(diào)控。因此，研究蛋殼礦化時(shí)期影響碳酸鈣沉積的關(guān)鍵候選基因及其遺傳變異對(duì)改善蛋殼品質(zhì)具有重要的意義。IP3R3基因群體遺傳特征分析顯示，g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位點(diǎn)多態(tài)信息含量均處于中度多態(tài)，揭示這2個(gè)SNP位點(diǎn)有較穩(wěn)定的遺傳力和育種選擇潛力[25]；卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，g.5539186 T>C位點(diǎn)和g.5540404 G>A位點(diǎn)均表現(xiàn)為Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期的人工選育使櫻桃谷鴨群體處在一個(gè)平衡狀態(tài)[26]。2個(gè)SNP位點(diǎn)均為同義突變，說(shuō)明IP3R3基因在遺傳進(jìn)化過(guò)程中有高度的保守性[27]。2個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，g.5539186 T>C位點(diǎn)和g.5540404 G>A位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡，說(shuō)明該群體趨向于獨(dú)立遺傳[28]。

本研究中，g.5539186 T>C位點(diǎn)對(duì)蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋形指數(shù)、蛋質(zhì)量和蛋殼質(zhì)量的影響均未達(dá)到顯著水平，g.5540404 G>A位點(diǎn)GG和GA基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度顯著高于AA基因型個(gè)體，與其他蛋殼品質(zhì)之間未達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)。蛋殼強(qiáng)度能保證蛋內(nèi)容物的完整性和安全性，是評(píng)價(jià)蛋殼品質(zhì)的最有力指標(biāo)，蛋殼強(qiáng)度增大，會(huì)使蛋的破損率大大減少[29]。推測(cè)這可能與IP3R3基因調(diào)控蛋殼腺內(nèi)鈣含量，從而影響蛋殼的鈣沉積有關(guān)。REN等[30]研究發(fā)現(xiàn)，基因的某單個(gè)突變位點(diǎn)可能受到其他多個(gè)突變位點(diǎn)的影響。AKEY等[31]在遺傳性疾病和性狀分析研究中發(fā)現(xiàn)，單倍型共同的作用可能比單個(gè)SNP位點(diǎn)的作用對(duì)性狀的影響更大?？梢姡谄贩N選育過(guò)程中不能只看單個(gè)突變位點(diǎn)。本研究中，通過(guò)對(duì)3種單倍型進(jìn)行組合，共發(fā)現(xiàn)5種雙倍型。理論上應(yīng)有6種雙倍型，另外1種雙倍型沒有檢測(cè)到，可能是因?yàn)樵谧匀贿x擇或人工選育過(guò)程中被淘汰，或是由于本研究的樣本量太少，沒有檢測(cè)到。將5種雙倍型與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，雙倍型H1H1、H1H3、H2H3和H3H3個(gè)體的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度顯著高于H2H2個(gè)體的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度。說(shuō)明2個(gè)SNP位點(diǎn)聯(lián)合引起基因結(jié)構(gòu)變化強(qiáng)于單個(gè)SNP對(duì)基因結(jié)構(gòu)變化的影響。因此，可以篩選g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位點(diǎn)作為鴨蛋蛋殼品質(zhì)選擇的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。此外，還可以從蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組等水平進(jìn)一步深入挖掘，提供更有育種價(jià)值的SNP位點(diǎn)或單倍型，以利于家禽育種。

綜上，g.5540404 G>A位點(diǎn)對(duì)蛋殼強(qiáng)度有顯著影響，2個(gè)SNP位點(diǎn)組合基因型對(duì)蛋殼厚度和強(qiáng)度也產(chǎn)生顯著影響，可以篩選g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位點(diǎn)作為櫻桃谷鴨鴨蛋蛋殼品質(zhì)選擇的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。