張新雨 ，范夢月，孫 蓉,

1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

2.山東大學第二醫(yī)院，山東 濟南 250033

3.山東大學高等醫(yī)學研究院，山東 濟南 250012

4.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是指胃和十二指腸功能紊亂引起的餐后飽脹感、早飽、中上腹疼痛和中上腹灼燒感等癥狀，而無器質(zhì)性病變的一組臨床綜合征，其發(fā)病機制復雜，發(fā)病率高，而且患者反復發(fā)作，嚴重影響生活質(zhì)量，并消耗了大量的醫(yī)療資源，已成為現(xiàn)今國內(nèi)外學者研究的熱點及難點之一[1-3]。FD根據(jù)其臨床癥狀，在中醫(yī)學上將其歸為“胃脘痛”“痞滿”等范疇[4]。中醫(yī)藥作為FD的藥物治療途徑之一，對其臨床癥狀及體征有明顯改善，而且對于其防治具有縮短病程、降低復發(fā)率、毒副作用小、適合長期服用的特點[5]。但是治療FD的各類成方、自擬方存在用藥多樣化以及個性化問題，難以掌握各藥物之間的配伍關系，給中醫(yī)藥的用藥經(jīng)驗傳承帶來困難。雖然前期已有研究人員對中醫(yī)藥治療FD用藥規(guī)律進行分析，但并未對其分析出的核心藥物進行潛在機制研究且搜集的處方年份不全[6-7]。近年來關于中醫(yī)藥治療FD的報道逐年增多，各醫(yī)家對FD的辨證分型以肝郁脾虛、肝胃不和最為常見，且肝郁脾虛為FD的主要病機[8-9]。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學的方式，選擇FD的重要證型肝郁脾虛為研究對象，分析總結(jié)中醫(yī)藥在治療肝郁脾虛型FD的用藥特點及核心藥物的潛在作用機制，以期更好地為肝郁脾虛型FD的臨床用藥以及新藥研發(fā)提供依據(jù)，并從組方用藥規(guī)律和功效網(wǎng)絡構建聯(lián)合角度闡釋“理-法-方-藥”一致性的科學性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“功能性消化不良”“肝郁脾虛”為檢索詞，在中國知網(wǎng)（CNKI）、維普、萬方數(shù)據(jù)庫檢索相關文獻，檢索自建庫至2020年11月30日的文獻。

1.2 納入標準

①文獻為臨床試驗研究；②文獻需為中藥復方治療肝郁脾虛型FD；③文獻中處方完整，中藥組成及用藥劑量明確；④用藥方式為口服。

1.3 排除標準

①動物實驗類文獻；②處方不完整，用藥劑量不明確的文獻；③重復發(fā)表的文獻。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將收集到中藥的名稱、功效以及性味歸經(jīng)參考《中國藥典》2020年版以及“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》進行標準化處理。如川楝、川楝子統(tǒng)一為川楝子，云苓、茯苓統(tǒng)一為茯苓，延胡索、元胡統(tǒng)一為延胡索，生半夏、清半夏、姜半夏統(tǒng)一為半夏。

1.5 肝郁脾虛型FD用藥規(guī)律分析

將規(guī)范處理好的中藥復方輸入Excel中，使用IBM SPSS Statistics 25、IBM SPSS Modeler 18以及Gephi進行性味歸經(jīng)、藥物使用頻次、用量、聚類、關聯(lián)規(guī)則、復雜網(wǎng)絡等分析和可視化處理。

1.6 網(wǎng)絡藥理學機制研究

結(jié)合“1.5.1”項下頻數(shù)統(tǒng)計、關聯(lián)規(guī)則以及聚類分析結(jié)果得到核心藥物，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[10]收集核心藥物化學成分，并基于口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進行篩選，同時結(jié)合文獻報道對篩選后的成分進行補充，最終確定其活性成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢活性成分相對應的靶標蛋白，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www.unitprot.org/）查詢靶標蛋白對應的基因名稱，剔除非人類的靶點蛋白，最終確定高頻藥對的活性成分及其對應靶點[10]。同時在 GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫中輸入關鍵詞“functional dyspepsia”，收集疾病的相關靶標，在DrugBank（https://www.drugbank.ca/）中檢索治療FD的一線藥物，獲取對應靶標，將所得靶標取并集，去除重復項得到FD的相關靶標信息。在藥智網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索疏肝健脾的中藥方劑以及中成藥，結(jié)合TCMSP以及文獻報道，收集其對應中藥的化學成分及其對應靶點，并根據(jù)肝郁脾虛的臨床主要表型“胸脅作痛、情志抑郁、腹脹、便溏”為檢索詞在HPO數(shù)據(jù)庫（https://hpo.jax.org/app/）檢索相關靶點，兩者合并得到肝郁脾虛證相關靶點。將肝郁脾虛證和FD靶標進行映射，得到肝郁脾虛型FD的靶點[11]。將高頻藥對的靶點與肝郁脾虛型FD的靶點進行匹配，得到高頻中藥治療肝郁脾虛型FD的關鍵靶點。利用Cytoscape構建“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，采用STRING平臺（https://string-db.org/）、DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對關鍵靶點進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻納入情況

以“肝郁脾虛”“功能性消化不良”為檢索詞，在中國知網(wǎng)、維普、萬方數(shù)據(jù)庫經(jīng)過合并去重后，共得到文獻606篇，根據(jù)本研究的納入和排除標準篩選后，得到文獻207篇。

2.2 性味歸經(jīng)分析

207個處方中共有119味中藥，依據(jù)《中國藥典》2020年版和《中藥學》的分類標準，對納入中藥的藥性藥味以及歸經(jīng)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示藥性以溫（34.29%）、平（31.34%），微寒（22.80%）為主；藥味以苦（49.71%）、辛（47.14%）、甘（43.41%）為主；歸經(jīng)以脾（72.68%）、胃（48.30%）、肺（37.85%）、肝（30.85%）為主。

2.3 藥物使用頻次分析

使用頻次≥15的藥物共有30味，見表1。其中出現(xiàn)頻次較高的中藥分別為柴胡、白術、甘草、茯苓、白芍、黨參、陳皮、半夏、枳殼和木香。

表1 治療肝郁脾虛型FD高頻藥物使用情況 (頻次≥15)Table 1 High-frequency drugs for treating FD with liver depression and spleen deficiency (frequency ≥ 15)

2.4 用量分析

對使用頻次排名前5的中藥（柴胡、白術、甘草、茯苓、白芍）進行用量統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，柴胡的最大劑量為25 g，最小劑量為5 g，10 g為柴胡的臨床常用劑量；甘草使用頻次最高的劑量為6 g；白術和茯苓的最大劑量均為30 g，使用頻次最高的均為15 g；白芍的最大劑量為40 g，使用頻次最高的劑量為15 g，10 g次之[12]。

圖1 藥物用量分析 (頻次排名前5)Fig.1 Analysis of drug dosage (top 5 in frequency)

2.5 關聯(lián)規(guī)則分析

將數(shù)據(jù)整理成0和1的格式，即用了這味藥物標記為1，沒用這味藥物標記為0。通過源節(jié)點，導入IBM SPSS Modeler 18軟件中，將數(shù)據(jù)類型選擇為標記，角色為二者，與圖選項板下的網(wǎng)絡節(jié)點相連接，選擇所有藥物，按照連接強度為低、中、高進行繪圖，制作出網(wǎng)絡圖，見圖2，其中連線的粗細代表關聯(lián)強度大小，由圖可見，柴胡、甘草、白術、茯苓、白芍具有較強相關性，在治療肝郁脾虛型FD的中藥處方中經(jīng)常共同出現(xiàn)。

圖2 治療肝郁脾虛型FD的中藥處方藥物關聯(lián)規(guī)則Fig.2 Association rules of traditional Chinese medicine prescription for treatment of FD with liver stagnation and spleen deficiency

在模型選項板下，將Apriori節(jié)點與類型節(jié)點相連接，按照預定義角色，設置最低支持度10%，最小置信度80%，最大前項為5，對藥物進行關聯(lián)規(guī)則分析。根據(jù)Apriori算法，一共產(chǎn)生2374條規(guī)則，關聯(lián)規(guī)則見表2～4。

表2 常用2種藥物組合關聯(lián)規(guī)則Table 2 Association rules of commonly used two drug combination

表3 常用3種藥物組合關聯(lián)規(guī)則Table 3 Association rules of commonly used three drug combination

表4 常用4種藥物組合關聯(lián)規(guī)則Table 4 Association rules of commonly used four drug combination

2.6 聚類分析

對使用頻次≥15的藥物進行聚類分析。將數(shù)據(jù)導入IBM SPSS Statistics 25.0中，選擇分析菜單，分類項下的系統(tǒng)聚類，由于預先不知道分類情況，聚類成員設置為5～10類進行探索性分析，連接方式為組間連接，方法為皮爾遜相關系數(shù)，生成聚類分析樹狀圖，見圖3。從圖3可以看出，聚為5類時，結(jié)果為類1（柴胡、甘草、白術、茯苓、白芍、陳皮、半夏、枳殼、麥芽、丹參、黃連）；類2（黨參、木香、香附、厚樸、雞內(nèi)金、枳實、砂仁、神曲、萊菔子）；類3（郁金、佛手、山楂、延胡索）；類4（當歸、生姜）；類5（黃芪、黃芩、大棗、干姜）。

圖3 藥物聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of drug cluster analysis

2.7 復雜網(wǎng)絡分析

首先將所有的藥物整理成共現(xiàn)矩陣格式，導入Gephi0.9.2軟件中。設置布局為 Fruchterman Reingold，區(qū)為10 000，重力為10，速度為1，點擊運行。在過濾窗口中，設置根據(jù)度值的大小決定節(jié)點的大小，模塊化的類型設置為不同的節(jié)點顏色，邊的厚度為1，點擊刷新即可得到復雜網(wǎng)絡圖。在數(shù)據(jù)表窗口中，可以看到復雜網(wǎng)絡的各個參數(shù)情況。提供軟件計算出節(jié)點個數(shù)、邊的個數(shù)、平均度、平均加權度、網(wǎng)絡直徑、網(wǎng)絡密度、平均聚類系數(shù)、平均路徑長度等指標。經(jīng)過計算，節(jié)點數(shù)為111，邊為1807，平均度為32.559，平均加權度為472.613，網(wǎng)絡直徑為2，網(wǎng)絡密度0.296?？傮w網(wǎng)絡圖見圖4。

圖4 總體復雜網(wǎng)絡圖Fig.4 Overall complex network diagram

利用K-core分析方法發(fā)現(xiàn)藥物核心組合。由圖5可見，K-core為25以上，白術在網(wǎng)絡中心，是非常重要的藥物，外圍形成了3個環(huán)，內(nèi)環(huán)為核心藥物，包括柴胡、甘草、半夏、麥芽、茯苓和枳殼。

圖5 K-core≥25的復雜網(wǎng)絡Fig.5 Complex network with K-core ≥ 25

2.8 網(wǎng)絡藥理學機制研究

根據(jù)頻數(shù)、關聯(lián)規(guī)則以及聚類分析和復雜網(wǎng)絡綜合分析的結(jié)果，對核心中藥柴胡、甘草、白術、茯苓的成分和靶點進行篩選，得到靶點共359個。在GeneCards、PubMed、TTD、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索FD的靶點，刪除重復項，得到FD相關靶點2499個，HPO檢索結(jié)果綜合疏肝健脾方中藥的靶點得到肝郁脾虛證的相關靶點1373個，將FD靶點與肝郁脾虛證靶點取交集，得到肝郁脾虛型FD靶點517個，核心中藥靶點與其映射得到中藥治療肝郁脾虛型FD的關鍵靶點212個。將關鍵靶點導入String數(shù)據(jù)庫獲取PPI網(wǎng)絡，見圖6。其中得分前10的靶點為蛋白激酶Bα（protein kinase Bα，AKT1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、腫瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、MYC原癌基因蛋白（MYC proto-oncogene，MYC）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、JUN原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN），表明這些基因在核心中藥治療肝郁脾虛型FD中具有重要作用，見圖7。利用Cytoscape軟件構建“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，見圖8，其中槲皮素、山柰酚、甘草次酸、異鼠李素、柚皮素為度（degree）值排名靠前的成分，在發(fā)揮治療肝郁脾虛型FD中有著重要作用。KEGG通路分析結(jié)果顯示，關鍵靶點顯著富集在癌癥相關通路、乙型肝炎、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路上，見圖9。

圖7 核心藥物治療肝郁脾虛型FD關聯(lián)性排名前10的靶點Fig.7 Top 10 targets in correlation of core drugs for FD with liver depression and spleen deficiency

圖8 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.8 Disease-drug-component-target network diagram

圖9 KEGG通路富集分析Fig.9 KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

目前，現(xiàn)代醫(yī)學普遍認為FD與胃腸功能運動障礙、內(nèi)臟高敏感性、幽門螺旋桿菌感染、胃酸分泌異常、精神心理等多種因素密切相關[13]。西醫(yī)對FD的治療主要包括促進胃腸動力、根除幽門螺旋桿菌、抑酸、抗焦慮、抗抑郁等，然而化學藥在治療FD的同時伴有毒副作用，并且停藥以后患者容易出現(xiàn)病情反復現(xiàn)象。近年來，中醫(yī)藥在FD實驗研究、臨床治療逐漸增加，顯示了中醫(yī)藥治療FD的優(yōu)勢[14]。本研究利用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學聯(lián)用的方法，初步探討了數(shù)據(jù)挖掘分析得到的核心藥物對治療肝郁脾虛型FD的潛在活性成分和功效作用網(wǎng)絡。

將納入研究的207個處方進行性味歸經(jīng)分析，結(jié)果表明中醫(yī)藥在治療肝郁脾虛型FD的中藥藥性以溫、平、微寒為主，藥味以苦、辛、甘為主，歸經(jīng)以脾經(jīng)、胃經(jīng)、肺經(jīng)、肝經(jīng)為主，F(xiàn)D初起以寒凝為主，病情日久郁而化熱或寒熱互見[15]，辛溫能散寒除痞，苦寒清降泄熱開痞，辛開恢復脾的升清功能，甘溫可補脾氣以和中，苦降可恢復胃的降濁功能，性味的有機結(jié)合可奏扶正祛邪之功[16]，F(xiàn)D的病位涉及肝、胃、脾，歸經(jīng)結(jié)果可與之相對應且表明在用藥時更加注重脾胃的治療，至于肺經(jīng)，在五行規(guī)律中，肺為脾之子，二者生理上相互為用[17]。藥物頻次分析顯示，其中疏肝理氣藥（柴胡、陳皮、枳殼）、健脾祛濕藥（白術、茯苓、白芍、甘草、黨參、木香）、降逆止嘔（半夏）使用頻次較高，且柴胡入肝經(jīng)，枳殼、白術入脾、胃經(jīng)，陳皮、茯苓、黨參入脾、肺經(jīng)，白芍入肝脾經(jīng)，甘草入肺、脾胃經(jīng)，木香入肝、脾、胃、肺經(jīng)，說明在治療肝郁脾虛型FD時，應以疏肝理氣、健脾益氣、宣降肺氣為主。

關聯(lián)規(guī)則顯示，柴胡-白芍，白芍-白術、柴胡，白芍-茯苓、白術、柴胡分別為同一個組里支持度最高的組合，有研究表明，白術揮發(fā)油可促進胃腸運動，顯著提高小腸推進率，白術內(nèi)酯I可調(diào)節(jié)腸管功能，促進腸管吸收，是健脾的重要成分[18]；柴胡可抑制胃酸分泌從而達到保護胃黏膜的作用，柴胡水提液可逆轉(zhuǎn)阿托品引起的胃腸蠕動抑制；白芍總苷可促使三硝基苯磺酸誘導的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道紊亂恢復[19]；同時茯苓多糖也具有調(diào)節(jié)胃腸道功能的作用[20-24]。

對頻次≥15的藥物進行聚類分析，聚類一為疏肝健脾湯加減，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效[25]；聚類二為加味三香湯，可疏肝理氣、健脾益氣[26]；聚類三為郁金、佛手、山楂、延胡索，郁金行氣解郁，佛手疏肝理氣，山楂、延胡索具有理氣行氣作用；聚類四為當歸、生姜，二者配伍可溫中補血，現(xiàn)可作為食療之良方；聚類五為黃芪、黃芩、大棗、干姜，黃芪配大棗補氣養(yǎng)血，干姜加黃芩可辛開苦降消痞。

復雜網(wǎng)絡分析顯示，在治療肝郁脾虛型FD的中藥中，白術、甘草、柴胡、茯苓扮演者重要角色，同時在關聯(lián)規(guī)則、聚類分析當中均有所體現(xiàn)，表明其可作為潛在的中藥配伍，為中藥復方治療肝郁脾虛型FD的核心藥物。

利用網(wǎng)絡藥理學的方法得到核心中藥治療肝郁脾虛型FD的重要成分為槲皮素、山柰酚、甘草次酸、異鼠李素、柚皮素等，研究表明槲皮素具有調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌、抗炎以及神經(jīng)保護的作用[27]，山柰酚可促進NO產(chǎn)生，保護胃黏膜，同時調(diào)控雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）發(fā)揮抗抑郁作用[28]，甘草次酸具有鎮(zhèn)靜安定作用[29]。IL-6能激活胃腸道黏膜下層神經(jīng)元，促進胃腸道蠕動及腺體分泌，研究表明香砂六君子湯改善FD的癥狀可能與減少相關白介素IL-2、IL-4、IL-6含量、促進胃腸動力的恢復有關[30]，剩余預測的核心中藥治療肝郁脾虛型FD關聯(lián)性極高的靶點在目前研究中尚未得到明確證實，如MAPK3、AKT1等，這為后續(xù)研究其分子作用機制提供新思路。KEGG通路分析顯示，核心中藥治療肝郁脾虛型FD的主要通路為癌癥相關通路、乙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路，PI3K/Akt通路在正常細胞增殖、分化、凋亡等細胞生理功能中起著重要的調(diào)節(jié)作用。實驗研究表明，β2-腎上腺受體（β2-adrenergic receptor，β2-AR）/PI3K/Akt通路活化可達到抑制胃腸道平滑肌細胞細胞存活的效果，同時，PI3K/Akt通路也可通過增加初級傳入神經(jīng)元中神經(jīng)肽和鈉通道的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)感覺超敏反應；結(jié)腸傳入神經(jīng)元可激活PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)辣椒素受體（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）蛋白的合成，從而介導內(nèi)臟高敏感神經(jīng)元興奮性，胃腸激素可差異性地調(diào)節(jié)Akt活性，如膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）的濃度變化會引起雙重調(diào)節(jié)，高低親和力CCKA受體可差異調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，Ghrelin可通過調(diào)節(jié)p38 MAPK來調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑改善細胞凋亡[31-36]。神經(jīng)活性配體-受體相互作用的受體基因主要包括血管活性腸肽受體2（vasoactive intestinal peptide-receptor 2，VIPR2）、

5-羥色胺1B受體（5-hydroxytryptamine receptor 1B，HTR1B）、生長激素促分泌素受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）等，VIPR2在身心應激造成的胃潰瘍大鼠模型中顯著增加，HTR1B表達下調(diào)影響5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的傳遞從而變現(xiàn)出內(nèi)臟高敏感，F(xiàn)D大鼠模型的GHSR的表達降低[37-40]，預測結(jié)果表明核心中藥治療肝郁脾虛型FD可能與改善腦腸肽水平有關，為進一步實驗提供參考。

綜上所述，本研究從組方用藥規(guī)律和功效網(wǎng)絡構建聯(lián)合角度闡釋了“理-法-方-藥”一致性的科學性，通過對中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫中關于肝郁脾虛型FD的方劑進行數(shù)據(jù)挖掘分析，初步揭示了中醫(yī)藥治療肝郁脾虛型FD的核心藥物以及配伍規(guī)律，同時得到治療該病潛在的中藥配伍，中藥復方治療肝郁脾虛型FD以疏肝理氣、健脾益氣為主，網(wǎng)絡藥理學研究得到核心中藥（柴胡、甘草、白術、茯苓）中的槲皮素、山柰酚、甘草次酸等成分作用于IL-6等關鍵靶點，參與PI3K-Akt信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路發(fā)揮治療肝郁脾虛型FD的作用，為探討其作用機制提供科學證據(jù)，同時為臨床應用的有效性提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突