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        結(jié)合逐步敲入策略與制劑工藝過程的腎寶片復(fù)雜成分辨識

        2021-07-21 02:28:02賈曉斌郭舒臣段龍強(qiáng)
        中草藥 2021年14期

        陸 萌,賈曉斌,郭舒臣,易 歡,段龍強(qiáng),耿 炤*,封 亮*

        1.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院,江蘇 南京 211198

        2.江西匯仁藥業(yè)股份有限公司 技術(shù)中心,江西 南昌 330052

        腎寶片由淫羊藿、紅參、肉蓯蓉等22味中藥組成,具有調(diào)和陰陽、溫陽補(bǔ)腎、扶正固本的功效,可用于治療腰腿酸痛、精神不振、夜尿頻多、畏寒怕冷等癥[1]。腎寶片的原劑型腎寶合劑在治療遺尿方面具有很好的療效[2],并具有助陽的功效與改善性功能的藥理作用[3]。腎寶片是內(nèi)科常用補(bǔ)益中成藥[4],但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確,現(xiàn)有研究大多是針對腎寶片中某一單味中藥中的化學(xué)成分進(jìn)行測定[5-7],缺乏系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。腎寶片與腎寶合劑制劑工藝不同,部分化學(xué)成分可能會發(fā)生變化。已有研究中主要測定了腎寶合劑中的淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及蛇床子素[8],本研究擬通過對腎寶片化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步辨識,對可能的新產(chǎn)生成分進(jìn)行解析,有助于對腎寶片制劑工藝過程的理解、認(rèn)識和進(jìn)一步的質(zhì)量控制。

        中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究一直是中藥現(xiàn)代化研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一,而對復(fù)方中藥進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分表征研究是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的前提。中藥復(fù)方具有多組分、多靶點(diǎn)、整體性的特點(diǎn),其藥味眾多、成分復(fù)雜,是大復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)解析的主要難點(diǎn)[9]。近年來對于中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,發(fā)展出了諸如中藥血清藥物化學(xué)研究[10]、譜效相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[11]、中藥整體藥代動力學(xué)研究[12]等方法,這些方法在闡釋中藥物質(zhì)基礎(chǔ)方面起到了一定的積極作用。本研究為系統(tǒng)表征腎寶片制劑工藝過程中得到的各提取物的化學(xué)成分,采用逐步敲入策略,利用超高效液相色譜(UPLC)與超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)解析各浸膏的化學(xué)成分,實(shí)現(xiàn)化學(xué)成分定性與分類,為腎寶片質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        按照腎寶片制劑工藝分別得到腎寶片浸膏1、2與全浸膏,采用UPLC重點(diǎn)分析表征浸膏1、2與全浸膏,并按照逐步敲入浸膏1、2的方法,驗(yàn)證全浸膏中的成分。在初步歸屬全浸膏譜中21個成分后,采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對腎寶片各提取物(浸膏)化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,建立化學(xué)成分快速鑒定方法,結(jié)合對照品與各單味中藥的相關(guān)文獻(xiàn),快速鑒定未知成分。整體技術(shù)路線圖見圖1。該方法較為全面系統(tǒng)地表征了腎寶片提取物的化學(xué)成分,為腎寶片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制方法的建立提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),對藥味組成復(fù)雜的中藥大復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)解析具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

        圖1 結(jié)合逐步敲入策略與制劑工藝過程的腎寶片復(fù)雜成分辨識技術(shù)路線圖Fig.1 Diagram of identification of complex components of Shenbao Pian based on stepwise knock-in strategy and preparation process

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Waters Xevo G2-XS QTof質(zhì)譜儀[配有電噴霧電離源(ESI)]、數(shù)據(jù)處理軟件MassLynx V 4.2和UNIFI,美國Waters公司;KH-300TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;Metter-Toledo GmbH XPR2電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;Milli-Q純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

        1.2 試藥與試劑

        對照品人參皂苷Rg1(批號G16S10Y97436)、人參皂苷Re(批號B04D9S76499)、人參皂苷Rb1(批號 Z20S9X70603)、金絲桃苷(批號Y08N9X74602)、槲皮素(批號C09S8Y43412)、蛇床子素(批號T08M8B30733)、類葉升麻苷(批號Y21A9H59554)、補(bǔ)骨脂素(批號C22A9Q68562)、異補(bǔ)骨脂素(批號C05M10Q82078)、大黃素(批號C18F8Q29652)、大黃素甲醚(批號T26A8F34784)、阿魏酸(批號L03A9D57744)、松果菊苷(批號Y29M10H84490)、五味子醇甲(批號Y30N10H104712)均購于上海源葉生物科技有限公司;對照品朝藿定A(批號19072204)、朝藿定B(批號18011604)、朝藿定C(批號19072404)、淫羊藿苷(批號18012906)、寶藿苷I(批號19083008)均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司;對照品人參皂苷Ro(批號19012811)、四羥基二苯乙烯葡萄糖苷(批號19012803)均購于維克奇生物科技有限公司;各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

        腎寶片及其中間品浸膏1、浸膏2與全浸膏,批號均為T1909156,江西匯仁股份有限公司。乙腈、甲醇為質(zhì)譜純,德國Merck公司;其余試劑均為色譜級。

        2 方法

        2.1 對照品溶液的制備

        取金絲桃苷、槲皮素、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品適量,精密稱定,加50%乙腈分別制成質(zhì)量濃度為116.5、219.7、199.2、201.6、164.6、215.4、204.2、217.2、199.0、196.0、165.6 μg/mL的混合對照品溶液,標(biāo)記為混合對照品溶液1。

        取蛇床子素、毛蕊花糖苷、補(bǔ)骨脂素、2,3,5,4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、異補(bǔ)骨脂素、大黃素、大黃素甲醚、阿魏酸、松果菊苷、五味子醇甲對照品適量,精密稱定,加50%乙腈分別制成質(zhì)量濃度為105.5、196.4、208.3、116.2、207.4、209.0、251.2、190.5、219.7、217.3 μg/mL的混合對照品溶液,標(biāo)記為混合對照品溶液2,混合對照品溶液1、2用于UPLC分析。

        分別取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成含各成分5~15 μg/mL的混合對照品溶液,標(biāo)記為混合對照品溶液3。

        分別取人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成含各成分5~15 μg/mL的混合對照品溶液,標(biāo)記為混合對照品溶液4。

        分別取松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、2,3,5,4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品適量,精密稱定,加50%乙腈分別制成含各成分1~5 μg/mL的混合對照品溶液,標(biāo)記為混合對照品溶液5。

        分別取沒食子酸、槲皮素、山柰酚、大黃素、大黃素甲醚、甘草苷、異甘草素對照品適量,精密稱定,加50%乙腈分別制成含各成分1~5 μg/mL的混合對照品溶液,標(biāo)記為混合對照品溶液6,混合對照品溶液3~6用于UPLC-Q-TOF-MS分析。

        2.2 供試品溶液的制備

        分別取浸膏1、2和全浸膏各1 g,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加適量50%乙腈超聲溶解,冷卻至室溫,加50%乙腈定容至刻度,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為浸膏1、2和全浸膏供試品溶液;分別吸取浸膏1、2供試品溶液各1 mL,等體積混合,0.22 μm微孔濾膜濾過,即得浸膏1+浸膏2供試品溶液;取腎寶片3片,除去包衣,研細(xì),取2 g,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加適量50%乙腈超聲溶解,冷卻至室溫,加50%乙腈定容至刻度,0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為腎寶片供試品溶液;50%乙腈作為空白供試品溶液。

        2.3 液相色譜條件1

        Waters H-class液相色譜儀;色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈;梯度洗脫:0~20 min,10%~20%乙腈;20~20.1 min,20%~24%乙腈;20.1~32 min,24%乙腈;32~32.1 min,24%~30%乙腈;32.1~38 min,30%~38%乙腈;38~42 min,38%~50%乙腈;42~50 min,50%~95%乙腈;50~57 min,95%乙腈;57~65 min,95%~10%乙腈;體積流量0.2 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長203、270 nm;進(jìn)樣量1 μL。

        2.4 液相色譜條件2

        Waters H-class液相色譜儀;色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈;梯度洗脫:0~10 min,5%~15%乙腈;10~15 min,15%~24%乙腈;15~25 min,24%乙腈;25~40 min,24%~60%乙腈;40~45 min,60%~73%乙腈;45~52 min,73%~95%乙腈;52~60 min,95%~5%乙腈;體積流量0.2 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量1 μL。

        2.5 液相色譜條件3

        Waters I-class液相色譜儀;色譜柱為Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈;梯度洗脫:0~0.5 min,22%乙腈;0.5~10 min,22%~95%乙腈;10~12 min,95%乙腈;12~12.5 min,95%~22%乙腈;12.5~14 min,22%乙腈;體積流量0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量為2 μL;2D檢測波長203、270 nm;用于UPLC-Q-TOF-MS分析浸膏1和全浸膏。

        2.6 液相色譜條件4

        Waters I-class液相色譜儀;色譜柱為Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈;梯度洗脫:0~0.5 min,5%乙腈;0.5~10 min,5%~50%乙腈;10~10.5 min,50%~95%乙腈;10.5~12 min,95%乙腈;12~12.5 min,95%~5%乙腈;12.5~14 min,5%乙腈;體積流量0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL;2D檢測波長260、300 nm;用于UPLC-Q-TOFMS分析浸膏2和全浸膏。

        2.7 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源(ESI)正、負(fù)離子模式分別進(jìn)行MSE掃描;低碰撞電壓6 V;高碰撞電壓30~70 V;采集質(zhì)量范圍m/z50~1200;毛細(xì)管電壓3 kV(ESI+)和2.5 kV(ESI-);錐孔電壓40 V;脫溶劑氣溫度500 ℃;脫溶劑氣體積流量1000 L/h;掃描時間14 min;亮氨酸腦啡肽(LE)實(shí)時校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù),正離子為m/z556.277 1,負(fù)離子為m/z554.261 5。

        2.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

        使用Masslynx V4.2和以中藥數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的UNIFI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。利用Waters Traditional Medicine Library成分庫搜索各單味中藥的化學(xué)成分,基于UNIFI在線軟件進(jìn)行化學(xué)成分鑒定與匹配,具體參數(shù)設(shè)置如下:在查找3D峰模塊勾選采用Lockmass進(jìn)行校正,高能通道強(qiáng)度閾值設(shè)為50 counts,低能通道強(qiáng)度閾值設(shè)為200 counts,勾選“Target by Retention time”,Target match tolerance設(shè)為5×10-3;Lockmass校正質(zhì)量數(shù):正離子為m/z556.276 6,負(fù)離子為m/z554.262 0。通過人工校驗(yàn)與核實(shí)各化合物的精確相對分子質(zhì)量以及碎片離子,確定浸膏1、2與全浸膏的化學(xué)成分。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 逐步敲入浸膏1、2驗(yàn)證全浸膏中的成分

        腎寶片成分復(fù)雜,根據(jù)不同成分的特點(diǎn),分別采用液相色譜條件1和2對浸膏1、浸膏2、浸膏1+2、全浸膏以及混合對照品溶液1、2與腎寶片進(jìn)行分析,按照逐步敲入浸膏1、2的方法,對全浸膏中的成分及來源進(jìn)行驗(yàn)證。

        在液相色譜條件1下重點(diǎn)分析了浸膏1中淫羊藿黃酮組分與人參皂苷組分,利用PDA檢測器設(shè)置雙波長,分別在270 nm下分析黃酮成分,在203 nm下分析皂苷成分,色譜圖見圖2、3。由圖2可推測腎寶片全浸膏中含有朝藿定A、B、C、淫羊藿苷及寶藿苷I、槲皮素與金絲桃苷,其中朝藿定A、B、C、淫羊藿苷及寶藿苷I來自浸膏1,槲皮素與金絲桃苷可能來自浸膏2。由圖3可知,僅通過保留時間較難推測全浸膏中是否含有人參皂苷Rg1、Re、Ro與Rb1,為進(jìn)一步驗(yàn)證浸膏1、2和全浸膏中是否含有上述成分,將利用LC-MS對各浸膏成分進(jìn)行鑒定。

        圖2 驗(yàn)證全浸膏中成分色譜圖 (液相色譜條件1, PDA: 270 nm)Fig.2 Validation of chromatogram of components in total extractum (liquid chromatography conditions1, PDA: 270 nm)

        圖3 驗(yàn)證全浸膏中成分色譜圖 (液相色譜條件1, PDA: 203 nm)Fig.3 Validation of chromatogram of components in total extractum (liquid chromatography conditions1, PDA: 203 nm)

        通過對色譜條件的摸索,在液相色譜條件2下重點(diǎn)分析了浸膏2中的成分,色譜圖見圖4。由于主要成分在前40 min出峰,因此,選取前40 min的色譜圖進(jìn)行對比,由圖4可推測全浸膏中含有阿魏酸、松果菊苷、二苯乙烯苷、毛蕊花糖苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子醇甲、大黃素、蛇床子素9個成分,其中阿魏酸、松果菊苷、二苯乙烯苷、毛蕊花糖苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、大黃素來自于浸膏2,且浸膏1對其無干擾,五味子醇甲、蛇床子素在浸膏2中的響應(yīng)很低,需進(jìn)一步通過液質(zhì)分析進(jìn)行驗(yàn)證。

        圖4 驗(yàn)證全浸膏中成分色譜圖 (液相色譜條件2)Fig.4 Validation of chromatogram of components in the whole infusion (liquid chromatography conditions 2)

        3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析浸膏1、2與全浸膏中的成分

        為進(jìn)一步驗(yàn)證全浸膏中是否含有上述21個成分,實(shí)現(xiàn)浸膏1、2與全浸膏的化學(xué)成分表征,利用UPLC-Q-TOF-MS對各浸膏進(jìn)行分析。由于浸膏1與浸膏2成分差別較大,因此,分別針對浸膏1與浸膏2建立2個色譜條件,以進(jìn)行浸膏1與浸膏2的成分特征性分析,浸膏1、2和全浸膏與混合對照品溶液正、負(fù)離子模式下基峰離子流圖見圖5、6。由于混合對照品溶液3中主要是淫羊藿黃酮類成分,在正離子模式下響應(yīng)較好,因此,僅在正離子模式下對其進(jìn)行分析,混合對照品溶液4中主要是紅參皂苷類成分,在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好,因此,僅在負(fù)離子模式下對其進(jìn)行分析。

        圖5 浸膏1、全浸膏基峰離子流圖Fig.5 Base peak intensity (BPI) of extractum 1 and total extractum

        圖6 浸膏2、全浸膏基峰離子流圖Fig.6 Base peak intensity (BPI) of extractum 2 and total extractum

        由圖5、6可知,各浸膏在對應(yīng)的色譜及質(zhì)譜條件下均較好的分離,將該原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件中,對比參考文獻(xiàn)與對照品,對成分進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果見表1~4。最終在浸膏1中檢測到17個成分,浸膏2中檢測到58個成分,在全浸膏中檢測到82個成分,實(shí)現(xiàn)了各浸膏的復(fù)雜成分表征。

        表1 浸膏1中化學(xué)成分的鑒定 (液相色譜條件3)Table 1 Components identification of extractum 1 (liquid chromatography conditions 3)

        4 討論

        腎寶片由22味中藥組成,化學(xué)成分復(fù)雜,分析時各成分之間容易產(chǎn)生干擾,因此,在建立UPLC針對各浸膏建立指紋圖譜時對色譜條件以及溶解樣品的溶劑進(jìn)行了優(yōu)化。

        考察了流動相中的有機(jī)相,乙腈與甲醇相比,腎寶片全浸膏的信噪比有明顯改善,因此,選擇乙腈作為有機(jī)相。并采用PDA全波長掃描,選擇最優(yōu)波長,針對浸膏1中的皂苷及黃酮成分,最終將檢測波長定為270 nm與203 nm,針對浸膏2中松果菊苷、補(bǔ)骨脂素等成分,檢測波長設(shè)為254 nm,混合對照品溶液2及浸膏中各成分的響應(yīng)均較好。由于浸膏中各成分溶解度差異較大,因此,分別考察了水、50%乙腈、75%乙腈以及乙腈作為溶解樣品的溶劑,50%乙腈對各成分的溶解性較好。并對梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化,建立了在同一色譜條件下對浸膏中多個成分分析的色譜條件。

        表2 全浸膏化學(xué)成分的鑒定 (液相色譜條件3)Table 2 Components identification of total extractum (liquid chromatography conditions 3)

        續(xù)表2

        表3 浸膏2化學(xué)成分的鑒定 (液相色譜條件4)Table 3 Components identification of extractum 2 (liquid chromatography conditions 4)

        續(xù)表3

        結(jié)合腎寶片制劑處方中各單味藥的用量,最終選擇21個成分對浸膏1、2以及全浸膏進(jìn)行分析,按照浸膏1、2逐步敲入的方式,驗(yàn)證全浸膏中的成分。在UPLC分析的基礎(chǔ)上,利用UPLC-Q-TOFMS對各浸膏中的成分進(jìn)行鑒定,由于前期基于多成分分析時建立的UPLC色譜條件分析時間較長,因此,以縮短分析時間、保證分離度為目標(biāo),對梯度洗脫程序進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

        表4 全浸膏化學(xué)成分的鑒定 (液相色譜條件4)Table 4 Components identification of total extractum (liquid chromatography conditions 4)

        續(xù)表4

        續(xù)表4

        通過對浸膏1色譜條件的優(yōu)化,將浸膏1的色譜條件優(yōu)化至14 min。最終,在浸膏1中檢測到17個化合物,所測成分中有9個化合物經(jīng)與對照品比對得到鑒定;在相同條件下對全浸膏進(jìn)行分析,在全浸膏中檢測到15個化合物,其中7個化合物經(jīng)與對照品比對得到鑒定,將此結(jié)果與浸膏1成分鑒定結(jié)果進(jìn)行比較,全浸膏中15個成分均在浸膏1中檢測到,即此15個成分均來自浸膏1。

        在浸膏2中檢測到58個化合物,其中6個化合物經(jīng)與對照品比對確認(rèn)。浸膏2中檢測到的成分主要包括:(1)肉蓯蓉苯乙醇苷組分:松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷;(2)黃芪皂苷組分:黃芪皂苷II、黃芪皂苷III、異黃芪皂苷IV、agroastragaloside II、agroastragaloside IV;(3)補(bǔ)骨脂香豆素組分:補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素;(4)制何首烏中蒽醌組分:大黃素、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷;(5)甘草黃酮組分:異甘草呋喃糖苷、甘草苷;(6)胡蘆巴皂苷組分:胡蘆巴皂苷Ib、胡蘆巴皂苷Ia、胡蘆巴皂苷Ⅱa;(7)黃芪黃酮組分:異槲皮苷、毛蕊異黃酮等。

        在相同色譜及質(zhì)譜條件下對全浸膏進(jìn)行分析,并對22味中藥的化學(xué)成分進(jìn)行搜索,通過對正、負(fù)離子模式下全浸膏成分鑒定結(jié)果進(jìn)行整理,共定性了82個化學(xué)成分,涵蓋了腎寶片中22味中藥,其中12個化學(xué)成分來自浸膏1,其余70個成分來自浸膏2,主要包括制何首烏中二苯乙烯苷組分和蒽醌組分、黃芪皂苷組分、補(bǔ)骨脂香豆素組分、胡蘆巴皂苷組分以及甘草黃酮組分等。

        本研究利用UPLC建立了各浸膏的指紋圖譜,基于逐步敲入策略以驗(yàn)證全浸膏中的成分,并利用UPLC-Q-TOF-MS快速、方便、有效地對腎寶片全浸膏化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,結(jié)合UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫、二級碎片離子信息以及對照品比對,實(shí)現(xiàn)了腎寶片各浸膏中復(fù)雜成分的快速辨識與歸屬,為腎寶片制劑工藝過程的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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